Generación de quimioluminiscencia

Bioq. Martín Pernigotti
martin.pernigotti@wiener-lab.com
Centro de Investigación y Biotecnología – Wiener Laboratorios SAIC, Rosario – Argentina

 

Introducción

La quimioluminiscencia es la generación de radiación electromagnética (luz) debido a la liberación de energía generada a partir de una reacción química. La radiación electromagnética puede emitirse en la región ultravioleta, visible o infrarroja, siendo aquellas pertenecientes al espectro visible las más comunes. En la naturaleza los “animales luminosos” son conocidos desde la antigua civilización griega. Sin embargo, la quimioluminiscencia “artificial o en laboratorio” fue descrita por primera vez en 1877 por Radziszewski quien observó la emisión de luz amarilla-verdosa cuando el oxígeno se burbujeó en una solución etanólica alcalina de 2,4,5-trifenilimidazol (lofina) (Figura 1).

Quimio - Figura 1 Cincuenta años más tarde, Albrecht informó las propiedades luminiscente del com¬puesto 5-amino-2,3-dihidroftalazina-1,4-diona (luminol). Por otra parte, en 1935 Gleu y Petsch, describieron la emisión de luz azul o verde del nitrato de bis-(N-metilacridinio) (lucigenina) (Figura 2).

Quimio - Figura 2

Las reacciones quimioluminiscentes se pueden agrupar en tres tipos. Por una parte, se encuentran las reacciones químicas que utilizan compuestos sintéticos (Luminol, ésteres de acridinio, etc.) y que por lo general involucran una especie reactiva del O2 (peróxidos, superóxidos) y/o medios alcalinos fuertes –OH (Figura 3). En los medios de reacción apróticos (dimetilsulfóxido o dimetilformamida), sólo el oxígeno y una base fuerte son necesarios para que se genere la quimioluminiscencia, mientras que disolventes próticos (agua o mezclas de disolventes/alcoholes, etc.), diversos derivados de oxígeno (oxígeno molecular, peróxidos, anión superóxido) pueden oxidar al luminol y sus derivados pero se requiere de catalizador enzimático (HRP) o mineral (persulfato, Fe3+, Co2+, Cu2+, etc.) para aumentar el rendimiento cuántico de la reacción quimioluminiscente. Por otra parte, un segundo tipo de reacción quimioluminiscente son las reacciones emisoras de luz que surgen a partir de un organismo vivo, tal como la de la luciérnaga y algunas medusas entre otros, se denominan comúnmente reacciones bioluminiscentes. Finalmente, el tercer tipo de reacción son las reacciones de emisión de luz que se producen por el uso de la corriente eléctrica se denominan reacciones electroquimioluminiscentes.

Quimio - Figura 3

Con el fin de alcanzar los más altos niveles de sensibilidad, una reacción quimioluminiscente debe ser lo más eficiente posible en la generación de fotones de luz. Cada compuesto o grupo quimioluminiscente pueden producir no más de un fotón de luz. Una reacción perfectamente eficiente tendría un rendimiento cuántico de quimioluminiscencia ΦCL=1, es decir, un fotón por molécula.

 

Aplicaciones

El uso de reacciones químicas que producen luz para la detección cuali/cuantitativa de biomoléculas es un campo en rápido crecimiento, principalmente en aplicaciones inmunoanalíticas. Las demandas técnicas de estos mercados requieren tecnologías de detección que son altamente sensibles, no demasiado propensas a interferencias, robustas y fáciles de aplicar. Los procesos quimioluminiscentes tienen suficiente sensibilidad y por lo tanto son muy adecuados para estas aplicaciones. La mayoría de los ensayos inmunológicos quimioluminiscentes son heterogéneos y requieren separación fases entre lo unido del marcador no unido a la fase sólida. Un ensayo homogéneo, en contraste, re­quiere que la reacción que produce luz sea afectada de algún modo por la unión del ligando a su receptor. A diferencia de la colorimetría o de las mediciones fluorescentes, las matrices de ensayo generalmente contribuyen poco o nada en la señal de quimioluminiscencia (muy baja señal de fondo), además no es necesaria ninguna fuente lumínica de excitación. La fuente más grave de señal de fondo viene de la interacción con el analito a través de even­tos de unión no específicos y es común a todos los inmunoensayos. La medición de la intensidad de la luz es relativamente simple. Requiere sólo un fotomultiplica­dor o fotodiodo y la electrónica asociada para convertir y grabar señales. La falta de fondo inherente y la capacidad de medir fácilmente intensidades de luz muy bajas y muy altas con una simple instrumentación proporcionan un gran potencial de rango dinámico de medición.

En medios acuosos existe un método co­mún para la generación de quimiolumi­niscencia y es el uso de una enzima para catalizar una reacción quimioluminiscente. Cada enzima (HRP, FAL y otras oxidasas) puede iniciar múltiples reacciones quimioluminiscentes. El compuesto quimiolumi­niscente se suministra como el sustrato de la enzima en exceso para asegurar la cinética de saturación. La intensidad de luz es una función lineal de la cantidad analito presente en la muestra. La intensidad, que es la tasa de emisión de fotones, es el producto de la reacción catalítica E + S → E + S’ (pasos 1-3, Figura 4) y el tiempo de vida media del compuesto S’→ P* (paso 4, Figura 4), que puede describirse con una ecuación para cinética de primer orden con una constante de velocidad k, por lo que el t1/2 = (ln 2)/k.

Quimio - Figura 4

El tiempo de vida media del estado excitado producto P*→ P (paso 5 que produce luz, Figura 5) es más corto en comparación con los otros pasos y no tiene ningún efecto sobre la cinética global de la reacción.

El perfil de intensidad/tiempo quimiolumi­niscencia consiste en un período de alza inicial hasta una emisión prolongada a un nivel de meseta o pseudo-meseta (Figura 5). Cuando la reacción de primer orden de S’→ P* es lenta, el tiempo necesario para alcanzar la meseta se extenderá hasta que la concentración de S’ en el estado esta­cionario se alcance. Cuando la reacción de S’→ P* es rápido, habrá un aumento rápido y emisión prolongada de quimioluminiscencia. La ausencia de un valor de meseta estable indica un agotamiento del sustrato o la inactivación de la enzima. La detección de quimioluminiscencia enzima-generada proporciona una gran flexibili­dad en el proceso de medición. La inten­sidad de luz en cualquier punto de tiempo a través de la meseta se puede relacionar con la cantidad de analito en la muestra. Para la máxima sensibilidad, la medición se debe realizar en la meseta de la cinética.

Quimio - Figura 5

En medios apróticos existe otra manera de utilizar una reacción quimioluminiscente para la detección de un analito en un in­munoensayo. El método consiste en marcar de forma covalente un anticuerpo o un antígeno directamente con un compuesto quimioluminiscente. Para activar la mar­ca quimioluminiscente se la somete a un medio con O2 y una base fuerte (-OH, pH> 10,00) con la cual se dispara la emisión de luz en forma de flash quimioluminiscente (Figura 6). Este es el método utilizado por muchos analizadores automáticos de inmunoanálisis quimioluminiscentes.

Quimio - Figura 6

Mecanismos de detección de quimioluminiscencia

Ya sea por una forma u otra, el rendimiento analítico debe ser altamente reproducible. El CV intra/inter ensayo debería del orden de 3-5%. El hecho de que un proceso de quimioluminiscencia no necesita radiación de excitación genera que los instrumentos utilizados para llevar la cuantificación necesitan sólo proporcionar una forma de detectar la luz y grabar el resultado. Dentro de los métodos más comunes se encuentran los luminómetros, las placas radiográficas y las cámaras digitales. Los luminómetros consisten de sólo una caja de muestra a prueba de luz y algún tipo de célula fotoeléctrica. Los tubos fotomultiplicadores (PMT) han sido tradicionalmente el principal detector usado en luminómetros (Figura 7). Sus ventajas incluyen una buena sensibilidad, un amplio rango diná­mico y aplicabilidad en un razonablemente amplio rango espectral. Los PMT generan una corriente de fondo muy baja lo que lleva a una excelente relación señal-ruido para muestras de baja intensidad. La carcaza del detector debe ser muy hermética a la luz. Niveles de iluminación moderados saturan el detector y niveles altos puede causar daños irreversibles en el PMT.

Quimio - Figura 7

Por otra parte, las películas fotográficas consisten de una placa de rayos X se utiliza ampliamente para grabar imágenes de ensayos de transferencia quimioluminiscentes realizados sobre membranas de nylon, nitrocelulosa o PVDF (Figura 8). El usuario debe tener en cuenta que la película de rayos X sólo es sensible a la radiación generada en el ultravioleta (zona de alta  energía) cercana a la región espectral azul por lo que si la radiación es verde-rojiza no será detectada por la placa.

Quimio - Figura 8

En lo que refiere a las cámaras fotográficas, hace relativamente poco tiempo los sistemas de cámaras CCD se han convertido en una herramienta competitiva para la obtención y almacenamiento de imágenes quimioluminiscentes (Figura 9). Estos sistemas son superiores en el rango dinámico de medición de señal y la respuesta es lineal a lo largo de 3-4 órdenes de magnitud frente a la película fotográfica de rayos X. Tiempo de toma de imagen es más corto y varias imágenes se pueden obtener y almacenar fácilmente. Los sistemas de cámaras CCD permiten imágenes de una variedad de objetos. Prácticamente cualquier tipo de muestra o recipiente puede ser acomodados y fotografiados, desde placas de micropocillos y tubos de ensayo a los cultivos bacterianos o de células en placas de Petri, geles de electroforesis y las membranas papel.

 Quimio - Figura 9

 

Microplacas

La luz emitida en las reacciones quimioluminiscentes es isotrópica, se emite por igual en todas las direcciones (Figura 10). Si un ensayo quimioluminiscente se llevó a cabo en los pocillos de una placa trans­parente, la luz podría dispersarse no sólo verticalmente, en la dirección del detector, sino también lateralmente en la dirección de otros pocillos. La luz se transmite fácilmente a través de los espacios entre pocillos y a través del propio material de la placa, un fenómeno llamado canalización de luz. Pocillos que contengan muestras relativamente brillantes introducirán in­terferencia significativa en los pocillos adyacentes y más allá. Por esta razón, qui­mioluminiscencia nunca se debe medir en microplacas transparentes.

Quimio - Figura 10

Pueden usarse microplacas de dos tipos, en blanco y negro. Los usuarios notarán una disminución significativa de la señal (aprox. 10 veces) usando las placas negras debido a la absorción de la luz. Dado que todos los pocillos se ven afectados proporcionalmente, independientemente de la intensidad, la cuantificación no se vea comprometida. La elección de la placa debe estar basada en la intensidad de la señal esperada, blanco para las reacciones de intensidad media/baja, negro para las reacciones más brillantes. Las placas negras también se pueden utilizar ventajosamente para disminuir un problema no específico la unión de fondo.

 

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