Automatización en hematología

Bioq. María Gabriela Alegre
malegre@wiener-lab.com.ar
Product Team – Wiener Laboratorios SAIC, Rosario – Argentina


El examen hematológico más frecuente es el hemograma, y sin duda alguna, una de las pruebas que más aporta al médico en la evaluación de un paciente. La evolución ha sido grande y vertiginosa hacia los últimos años, desde el método manual hasta los equipos modulares más sofisticados, con tecnologías combinadas, ingeniería y software innovadores que permiten una mayor eficiencia y seguridad en el informe de los resultados. Los beneficios en la automatización de la hematología se ven fácilmente y vienen de la mano de la mejora de la productividad, la reducción de los costos operativos, la mayor precisión, exactitud, trazabilidad de los resultados, la optimización de los recursos, y la incorporación de nuevos parámetros que permiten ampliar la capacidad diagnóstica y pronóstica del área, entre otros. Todo esto lleva a una mejora integral del resultado, lo cual permite trabajar con un alto nivel de confianza. El hemograma como prueba de laboratorio permite tener una visión global de la homeostasis del sistema hematopoyético, de ahí la importancia de que se evalúen el mayor número de parámetros y, sobre todo, de que éstos tengan la mayor precisión y exactitud posibles. Este artículo, sin pretender agotar el tema, busca presentar la evolución tecnológica en la hematología, más específicamente en los hemogramas.

La primera Generación: el método manual
En este sentido la técnica manual para la elaboración de los hemogramas adolece de los problemas que afectan a la mayoría de las técnicas manuales de cualquier disciplina del laboratorio: por un lado, el aumento del volumen de trabajo en tal magnitud que atenta contra la calidad del mismo y con el cual la práctica manual pierde credibilidad; y además, existe una demanda que precisa reportar un mayor número de parámetros que manualmente no se alcanzaría, y los que podrían calcularse mediante fórmulas no son confiables, ya que provienen de recuentos con CV muy altos. (Tabla 1)

La automatización en hematología trae aparejado:
– Mayor eficiencia: permite procesar un gran volumen de pruebas en menos tiempo.
– Mejora en la precisión y la exactitud: de la mano de las calibraciones y programas de controles internos y externos.
– Reducción de errores.
– Estandarización: Manejo de estándares y muestra de la misma forma.
– Reducción de Costos Operativos
– Aumento de Bioseguridad

Segundo Generación: comienzos de la automatización
El primer método para el recuento electrónico de células sanguíneas fue publicado en 1934; en esta técnica el conteo se realizaba mediante la detección fotoeléctrica de la luz dispersada. Las potencialidades de estos procedimientos no encontraron en aquella época aplicación en la hematología. No fue hasta 1956 que se diseñó el primer contador automático de células utilizando los modelos creados en años anteriores. Esto representó el nacimiento del primer contador Coulter modelo A.

Los primeros contadores celulares, aunque constituyeron un avance importante, sólo eran capaces de realizar conteos electrónicos globales de eritrocitos y menos satisfactoriamente, de leucocitos; no obstante, marcaron la ruta para la innovación y perfeccionamiento de varias generaciones de estos equipos. Se trataba de instrumentos semiautomatizados. La preparación de una dilución adecuada era una operación manual y el instrumento entonces, aspiraba la dilución ya preparada. El beneficio se debía a que el número de células contadas era mucho mayor que en los recuentos microscópicos, reduciendo así el error.

Tercera Generación: automatización
La tercera generación incorporó mejoras a la ingeniería de los contadores, la discriminación de la población de glóbulos blancos en tres diferenciales: linfocitos, células medias y granulocitos neutrófilos. Componentes básicos de un contador hematológico. Figura 1

Figura 1 1

Circuito hidráulico
– Diluidor/Dilutor: sistema que diluye la concentración de las células sanguíneas y las suspende en soluciones conductoras isotónicas para adecuarla a las capacidades de medida del dispositivo.
– Aspirador: sistema que toma la muestra diluida y la conduce hacia el dispositivo de medida.
– Sistema de fluidos: transporta las suspensiones celulares hacia el dispositivo de medida o la cámara de recuento.
– Cámara de recuento o dispositivo de medida: constituye la parte central o zona sensible del equipo, donde ocurren los fenómenos ópticos, eléctricos o ambos, medidos posteriormente. Algunos equipos poseen solo una cámara de recuento por lo que les lleva el doble de tiempo la lectura.

Circuito Electrónico
Transductor o detector: son los dispositivos que generan linealmente pulsos eléctricos cuando las células pasan la zona sensible, óptica o eléctrica, del equipo.
– Discriminador: discrimina los pulsos eléctricos generados por los transductores en correspondencia con el tipo celular medido.
– Amplificador: amplifica la señal eléctrica que sale del discriminador para su posterior procesamiento.
– Convertidor analógico-digital: convierte las señales eléctricas en digitales.
– PC: procesa las señales digitales y las convierte en datos que serán mostrados en pantalla y que pueden ser impresos.

Circuito neumático
Está constituido por las válvulas y los pistones que ejercen la presión para que se desplacen los fluidos por el circuito hidráulico.

Recuento Celular: Impedancia
También conocida como principio Coulter, en honor al ingeniero Wallace Henry Coulter quien lo describió en 1956, no sólo revolucionó la hematología sino que inició la era de los autoanalizadores hematológicos. El método se basa en la resistencia que presentan las células que no son conductoras eléctricas al paso de la corriente eléctrica cuando atraviesan un pequeño orificio, conocido como “orificio de apertura” que separa dos medios con
diferente potencial, como se esquematiza en la Figura 2. Figura 2Cada vez que una célula atraviesa el orificio de apertura se presenta un cambio en la resistencia eléctrica que el instrumento interpreta como un pulso que es proporcional al volumen del líquido electrolítico desplazado.
Bajo estas circunstancias, el número de pulsos generados indica el número de partículas que pasan a través de la apertura.
La amplitud de cada uno de los pulsos es proporcional al volumen de cada una de las partículas. El pulso se amplifica y se compara con los canales internos de tensión de referencia que, únicamente acepta pulsos de una amplitud determinada. Mediante un software se construye un gráfico conocido como “histograma”, obtenido a partir del número y tamaño de los pulsos. La distribución y el tamaño de los mismos permiten identificar las
poblaciones celulares y los coeficientes de variación de cada una de ellas (Figura 3). Figura 3

Para el recuento de glóbulos blancos se utiliza un lisante que, lisa los glóbulos rojos, permea la membrana de los glóbulos blancos, es decir, crean poros en la membrana de los leucocitos produciéndose una difusión lenta del citoplasma del leucocito y quedando la membrana adherida al núcleo (se mide volumen nuclear), estabiliza los glóbulos blancos y acompleja la hemoglobina.

En el histograma de glóbulos blancos (Figura 4) se pueden observar las tres poblaciones bien diferenciadas: linfocitos, células medias y granulocitos neutrófilos. Tecnología para la determinación de hemoglobina Si bien el método de referencia continúa siendo el de Cianometahemogobina (Figura 4según el documento H26 A2 del Clinical and Laboratory Standars Institute), al tratarse de una sustancia tóxica, hoy en día los equipos han remplazado los reactivos con cianuro por reactivos libres del mismo. La lectura se realiza entre 525nm y 555nm dependiendo del producto.

Interpretación del cuadro hemático 3 Diferencial – Informe numérico 

Los parámetros informados pueden clasificarse en los que son medidos directamente, los que se obtienen a partir de los histogramas y los que se obtienen por cálculo. Parámetros obtenidos a partir de mediciones: glóbulos blancos (WBC), glóbulos rojos (RBC), hemoglobina (HGB) y plaquetas (PLT). Parámetros obtenidos a partir de los histogramas: % linfocitos (Lymph%), % células de tamaño medio (Mid%), % granulocitos (Gran%), volumen corpuscular medio (MCV), amplitud de distribución eritrocitaria (RDW-CV y RDW-SD), volumen plaquetario medio (MPV), amplitud de distribución plaquetaria (PDW). Parámetros obtenidos a través de cálculos: linfocitos (Lymph%), células de tamaño medio (Mid%), granulocitos (Gran%), hematocrito (HCT), hemoglobina corpuscular media (MCH), concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC) y plaquetocrito (PCT).

De todos los parámetros informados resultan  de vital importancia los índices hematimétricos, ya que debido a su gran estabilidad son muy confiables, representando excelentes indicadores de calidad del desempeño del instrumento.

Cuarta Generación: diversificación de la tecnología
En los equipos considerados de cuarta generación vemos interactuar diferentes tecnologías como, impedancia, refracción, conductividad, opacidad celular, absorción de luz, citoquímica, fluorescencia, etc. Teniendo en cuenta diferentes propiedades de los grupos celulares que incluyen los dispersogramas (Figura 5).Figura 5

Se trata de un análisis tridimensional de las células y se informa su clasificación en las 5 poblaciones: neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos y monocitos. En los gráficos se observa el tamaño o volumen en el eje
Y del plano cartesiano y la complejidad celular en el eje X. Estas metodologías, en muchos casos, son similares entre si y utilizan la citometría de flujo como nuevo fundamento de lectura.

Citometría de flujo: componentes de un citómetro
Un citómetro está compuesto, básicamente, por una fuente de luz emisora, usualmente un láser, filtros de dispersión y de reflexión, detectores y una PC para recibir y procesar toda la información recabada. La citometría de flujo es utilizada en gran cantidad de estos equipos unidos a reactivos con fluorocromos o con reactivos citoquímicos (Figura 6).Figura 6
– Las células se inyectan en una celda de flujo que se encuentra en el camino óptico de una fuente de luz, normalmente un láser.
– La celda de flujo contiene un líquido isotónico que fluye rápido: “Flujo de barrido” que lleva el fluido de muestra a alta velocidad más allá de la fuente de luz.
– Las células mantienen su orientación y posición en la celda de flujo debido a las características laminares de fluido envolvente, y pasan fila india a través del haz láser: enfoque hidrodinámico. Esto permite dirigir las células a través de la apertura, lo que reduce el pasaje coincidente, la distorsión del tamaño de las partículas y la recirculación de las células sanguíneas alrededor de la apertura.
– Las células al atravesar el haz de luz la dispersan en múltiples ángulos. Se miden de forma frontal (Forward Scatter) y lateral (Side Scatter). La dispersión Frontal de la luz da idea del tamaño celular y la dispersión lateral de la complejidad.
– Los datos obtenidos son almacenados en la memoria y desde allí pasados a archivos que posteriormente pueden ser analizados con detenimiento.

Análisis de fluidos corporales
Muchos analizadores de cuarta generación proporcionan recuento total de células, de eritrocitos y leucocitos y un diferencial de los polimorfo y mononucleados para todas las muestras de fluidos corporales comunes (LCR, sinovial y serosos).

Serie blanca – Recuento de granulocitos inmaduros.
Numerosos equipos ofrecen un diferencial de 6 partes, el cual incluye el conteo total reportable de granulocitos inmaduros (IG%, %). Este conteo incluye promielocitos, mielocitos y metamielocitos.

Serie roja – NRBC (células nucleadas de serie roja)
Bajo condiciones normales las células nucleadas de serie roja (NRBC) se encuentran sólo en la sangre fetal y de neonatos. En muy raras ocasiones pueden ser liberados de la médula ósea en una rápida regeneración de la anemia, como por ejemplo en la recuperación de un déficit importante de vitaminas o luego de hemorragias severas.
Actualmente, aquellos equipos que los miden los cuentan automáticamente y se corrige el recuento de glóbulos blancos (WBC).

Serie roja – Reticulocitos
Otro de los parámetros incorporados en los equipos de cuarta generación es el recuento de reticulocitos (RET%) y sus índices derivados: fracción de Reticulocitos Inmaduros (IRF), Hemoglobina reticulocitaria (RHE), ancho de distribución de la hemoglobina reticulocitaria.
Los recuentos de reticulocitos en los equipos automatizados se realizan por tinción con un colorante fluorescente o con uno supravital dependiendo la marca. Ambos se unen a los restos de RNA de los ribosomas del reticulocito.
Como se ha mencionado, los reactivos fluorescentes tiñen los restos de RNA de la célula, es por ello que se pueden identificar las subpoblaciones de reticulocitos de acuerdo con la fluorescencia (elevada, media y baja) que corresponden al grado de maduración de los mismos, en donde los primeros son los reticulocitos más jóvenes o inmaduros, en tanto que los últimos representan los reticulocitos más maduros y cercanos al eritrocito adulto. Un parámetro relacionado con los reticulocitos con futuro en el ámbito clínico es la fracción de reticulocitos inmaduros (IRF), ya que permite identificar con mayor antelación la recuperación de la medula ósea postransplante. Un incremento del 2% en la fracción de reticulocitos inmaduros durante dos días consecutivos es indicador sensible de la recuperación de eritropoyesis.

Otro de los parámetros relacionados es la Hemoglobina Reticulocitaria (RHE). Es de importancia en la detección precoz de la disminución de los niveles del depósito de hierro. El ancho de distribución de la Hemoglobina representa la desviación estándar de la concentración de la hemoglobina en el histograma de los eritrocitos. Plaquetas
Según su forma de lectura, las plaquetas pueden ser contadas y analizadas mediante la impedancia y/o por la dispersión óptica. Algunos equipos de cuarta generación miden por impedancia y cuando encuentran  una alarma realizan una medida por dispersión, otros directamente miden por dispersión. Las plaquetas reticuladas o plaquetas inmaduras son plaquetas jóvenes, de 1 a 2 días, que se caracterizan por una alto contenido de ARN que puede ser coloreado con un fluorocromo, como la auramina O, y cuantificado de forma independiente mediante un citómetro de flujo o por láser. La fracción de plaquetas inmaduras es un parámetro usado para evaluar la trombopoyesis.  Otras características técnicas destacables

La automatización en hematología ha introducido mejoras en todos los aspectos
del área, como ser:
– Manejo de muestras: disponen de autosamplers, agitadores y nuevos dispositivos de toma de muestras que agilizan la gestión y procesamiento.
– Introducción de pantallas touch screen, conectividad y múltiples puertos, para facilitar la entrada y salida de datos del contador hematológico.
– Mantenimiento remoto del instrumento mediante internet.
– Software que permiten la incorporación de nuevos parámetros.
– Programas de calidad interlaboratorial.
– Mejor control de los resultados: utilizan las guías de consenso de la ISLH (International
Society for Laboratory Hematology).
– Nuevo enfoque para el manejo de reactivos: algunos equipos han implementado reactivos concentrados para minimizar el recambio.
– Tinción y visualización: varias marcas han lanzado instrumentos que permiten la realización y la tinción de los extendidos de sangre periférica.
– Equipos Modulares: la posibilidad de acoplamiento de dos o más contadores hematológicos, módulos preanalíticos, equipos para la tinción de láminas y equipos para la visualización de las mismas, permite hoy en día automatizar de forma completa todo el proceso para la elaboración de un hemograma completo.
Conocer y comprender las tecnologías actuales disponibles en el mercado, nos permite, por un lado, trabajar mejor, informando con conocimiento acabado del tema pudiendo sugerir nuevos parámetros indicadores de diagnóstico o tratamiento al cuerpo médico; y además conocer cuál es la oferta del mercado para comparar y elegir no bajo la presión del oferente de turno sino bajo la premisa de las necesidades propias.

 

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