ESTANDARIZACIÓN DE LA DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD LIPASA

María Laura Orcellet – Mauricio Rassetto
marialaura.orcellet@wiener-lab.com / mauricio.rassetto@wiener-lab.com
Centro de Investigación y Biotecnología – Wiener Laboratorios SAIC, Rosario – Argentina


La lipasa pancreática humana es una glicoproteína con un peso molecular de 48 kDa, producida principalmente en el páncreas y en pequeñas cantidades por las glándulas salivales y mucosas gástricas, intestinales y pulmonares. Su concentración en páncreas es aproximadamente 9000 veces mayor que en otros tejidos. La lipasa es la proteína más importante en el metabolismo de los triglicéridos; esta enzima los escinde liberando ácidos grasos libres y 2-monoglicéridos. La actividad normal de lipasa varía entre 3 y 70 U/L. La actividad lipasa depende de la presencia de sales biliares y de un cofactor proteico, llamado colipasa, secretado por el páncreas. La actividad lipasa también depende del sustrato, que en condiciones fisiológicas son ésteres de glicerol de ácidos grasos de cadena larga (triglicéridos) presentes en forma de emulsión. La colipasa, asistida por las sales biliares que estabilizan la emulsión de triglicéridos, se une a la lipasa formando un complejo. Esta asociación provoca un cambio conformacional en la lipasa, que le permite unirse más eficientemente al sustrato y lograr un mayor rendimiento en la reacción (Figura 1).

fig 1
Figura 1: Representación esquemática de la activación de Lipasa pancreática en
solución por Colipasa y una micela.

La determinación de la actividad lipasa es útil para el diagnóstico y tratamiento de las patologías del páncreas como pancreatitis aguda y obstrucción del conducto pancreático. El aumento en sus valores se considera un parámetro más específico para el diagnóstico que el incremento en la actividad catalítica de la amilasa sérica. En 1932, Cherry y Crandall desarrollaron el primer método para la cuantificación de la actividad lipasa, utilizando una emulsión de aceite de oliva como sustrato. Desde 1932, se reportaron numerosas metodologías para esta determinación: se han utilizado tanto sustratos triglicéridos como no triglicéridos en ensayos titrimétricos, turbidimétricos, colorimétricos, de fluorescencia e inmunológicos.
El objetivo de la estandarización es la obtención de resultados comparables en muestras humanas, independientemente de los reactivos utilizados, del instrumental y del laboratorio donde se realice el ensayo. Para alcanzar este objetivo en enzimología clínica, la IFCC (siglas en inglés de la Federación Internacional de Química Clínica) ha establecido sistemas de medición de referencia para aquellas enzimas con mayor relevancia clínica. Estos sistemas están basados en los siguientes requerimientos:
a)métodos de referencia, con procedimientos bien descriptos y exhaustivamente evaluados;

b) materiales de referencia apropiados;

c) laboratorios de referencia.

Utilizando este sistema de referencia y los procedimientos permanentes del fabricante, la industria puede asignar valores trazables a calibradores comerciales. Los laboratorios clínicos, que emplean procedimientos de rutina con calibradores validados para medir actividad enzimática en muestras humanas, pueden finalmente obtener valores trazables a procedimientos de referencia de mayor orden.
La actividad catalítica de una enzima no es una cantidad de sustancia medible, sino que es una propiedad medida a través de la velocidad de catálisis de la reacción, producida en un ensayo específico. Si los componentes del sistema de reacción (pH, buffer, temperatura, presencia de activadores/inhibidores, cantidad de sustrato, etc.) se modifican, la magnitud de la actividad medida también se verá afectada. Es por esto que el resultado numérico de las mediciones de actividad catalítica depende completamente de las condiciones experimentales bajo las cuales se realiza el ensayo.
Por medio de la estandarización de las medidas de actividad enzimática se obtendrían resultados comparables para una muestra humana, independientemente del kit e instrumento utilizados. Para alcanzar este objetivo se necesita lograr una transferencia confiable de la veracidad del valor medido desde un método de mayor orden a los métodos que se emplean habitualmente en los laboratorios. Dicho Sistema de Referencia (RMS, por sus siglas en inglés “Reference Measurement System”) está basado en conceptos de trazabilidad metrológica y en una jerarquía de procedimientos de medición. Este sistema también requiere de materiales de referencia, para la transferencia intermedia de valores a partir del procedimiento de referencia para los ensayos de laboratorio de rutina. Los laboratorios que producen reactivos para IVD pueden entonces utilizar estos materiales de referencia para asignar valores a los calibradores comerciales. Los laboratorios clínicos que utilizan kits comerciales y calibradores validados pueden obtener valores de muestras de pacientes trazables a un procedimiento de referencia, independientes del método o el instrumento, permitiendo la globalización de los resultados medidos (Figura 2).

fig 2
Figura 2: Sistema de referencia para la medición de actividad enzimática.

Entre las enzimas medidas en los laboratorios clínicos la única que aún no se encuentra estandarizada es la lipasa pancreática. Actualmente las actividades de la Comisión de Sistemas de Referencia de Enzimas de la IFCC se dirigen principalmente a la definición de un procedimiento de medición de referencia para esta enzima. La situación de la lipasa pancreática es algo diferente a la de otras enzimas, ya que ningún método fue previamente aprobado por la IFCC como referencia. La lipasa pancreática es una enzima particular que exhibe su actividad catalítica en la interfaz lípido-agua. El método propuesto anteriormente como referencia (Tietz et al, 1989) utiliza un procedimiento complejo de realizar y un sustrato cuya preparación es muy difícil de estandarizar y con instrumentación diferente a la comúnmente utilizada en los métodos de rutina; por lo que el Comité decidió trabajar sobre métodos fotométricos que utilicen sustratos solubles. Actualmente se encuentran en evaluación dos métodos: uno utiliza como sustrato el 1,2-dioleoylglycerol (DODG), el cual es hidrolizado por la lipasa pancreática. Diferentes reacciones enzimáticas acopladas generan incrementos de NADPH el cual es proporcional a
la actividad lipasa pancreática (Figura 3).

fig 3
Figura 3: Cascada de reacciones de catálisis del 1,2-dioleilglicerol. MGLP: Monoacilglicerol
lipasa; GK: Gliceraldehído Quinasa; ADP-HK: Hexoquinasa dependiente de ADP; G6PDH: Glucosa-
6-fosfato deshidrogenasa.

Un segundo método utiliza 1,2-dilaurilglicero- 3-ácido glutarico-(6-metilresorufina)- ester (DGGR) como sustrato, emulsificado con ácidos biliares, en presencia de colipasa. La lipasa pancreática genera el éster de ácido glutárico-(6-metilresorufina) que se descompone espontáneamente dando ácido glutárico y metilresorufina, siendo este último un compuesto coloreado, y se mide a 570 nm. La velocidad de aparición de color rojo resulta directamente proporcional a la actividad enzimática (Figura 4).

fig 4
Figura 4: Cascada de reacciones de catálisis del éster de ácido glutárico. El derivado metilresorufina es coloreado y permite la lectura de
absorbancia a 570 nm.

Se realizaron varios experimentos multicentro con el objetivo de probar los dos métodos, pero lamentablemente ambos presentaron alguna debilidad. En particular, la especificidad por la lipasa pancreática y la reproducibilidad en la preparación de los sustratos son los aspectos más críticos. Además, el método DODG puede ser influenciado por lipasas no pancreáticas, tales como la lipoprotein lipasa y la lipasa hepática que son liberadas al torrente sanguíneo cuando se administra heparina. Los miembros de la Comisión de Sistemas Enzimáticos de Referencia de la IFCC están trabajando para tratar de resolver estos problemas que parecen más exigentes que la evaluación inicial.


Imagen destacada adaptada de: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/89/Gastriclipasepng.png

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