Generación de quimioluminiscencia a partir de dioxetanos

Bioq. Martín Pernigotti
martin.pernigotti@wiener-lab.com
Centro de Investigación y Biotecnología – Wiener Laboratorios SAIC, Rosario – Argentina


En la edición Nº 164 del Notiwiener, se describió la generación de quimioluminiscencia a partir de compuestos derivados de la molécula del luminol, en esta ocasión se tratará el tema de la generación de quimioluminiscencia con compuestos derivados del dioxetano y catalizada por la reacción entre dicho sustrato y la enzima fosfatasa alcalina.

Adamantil dioxetane phophate (AMPPD)
Es el dioxetano de última generación, térmicamente más estable y utilizado en las plataformas más modernas de CLEIA (Chemiluminescence Enzyme Immunoassay) disponibles en el mercado. Su nombre real es 3-(2′-spiroadamantyl)-4-methoxy-4-(3″-phosphoryloxy)-phenyl-1,2-dioxetane, se lo suele nombrar AMPPD por sus siglas. Su fórmula molecular es C18H23O7P, y su peso molecular 382,34 g/mol. Figura 1
La misma está compuesta por un grupo dioxetano al cual está unido un grupo spiroadamantil y un grupo metoxifenilo, que a su vez se une a un fosfato. Esta molécula es quimioluminiscente, y la reacción es catalizada por la enzima Fosfatasa Alcalina (AP) según la reacción que se muestra en la Figura 2.
Luego de la escisión del grupo fosfato por la AP, se forma el anión AMP-D, el cual es moderadamente estable (2-30 minutos de vida media, dependiendo del medio). Luego el dioxetano se fragmenta formando un intermediario que será el que emitirá luz a 470 nm.
El fosfato cumple la función de trigger o desencadenador de la reacción. Tras la hidrolización de éste por medio de la AP, se forma en anión 3-(2′-spiroadamantyl)-4-methoxy-4-(3″-hydroxyphenyl)-1,2-dioxetane (m-AMPD). El cual luego se descompone dando el intermediario methyl m-oxybenzoate anion (m-MOB−), quién finalmente es el que libera luz. Figura 3

Diagramas de energía
La formación de compuestos carbonílicos excitados tras la descomposición del dioxetano favorece la emisión de luz, esto se debe a que existe la energía suficiente para generar moléculas electrónicamente excitadas en estados singletes (S) y triplete (T). Cuando la molécula que se encuentra en el estado S decae, es cuando se produce la emisión de luz.
Estos dioxetanos (como se ve en la figura 4 y 5), son poco estables térmicamente, además poseen bajo rendimiento lumínico, ya que se favorece la producción de intermediarios con estados electrónicos T y no S. (Adam et al, 1996).

 

 

 

 

 

 

 

 

Los derivados del adamantano son muy estables térmicamente; por lo tanto, el grupo spiroadamantil tiene la función de darle estabilidad térmica a la molécula y aumentar así su vida media.
Los anillos aromáticos han mostrado aumentar los rendimientos lumínicos, ya que estabiliza el anión. Se utiliza el metil m-hidroxibenzoato el cual se sabe que es un buen fluoróforo (Adam et al, 1996). Figura 6
El fluoróforo puede dar una señal en forma de flash o glow, según como esté el grupo donor (posición meta o para) respecto el aceptor. Cuando están en posición meta (m-AMPPD) la luminiscencia es del tipo glow (emisión sostenida en el tiempo), mientras que en la posición para (p-AMPPD) es del tipo flash (emisión intensa y rápida). Para la utilización de esta herramienta en imnunoensayos es necesario que sea tipo glow (Adam et al, 1996; Yue and Liu, 2013). Figura 7

Cinética de emisión

La cinética de la emisión de la luz es el resultado característico de una reacción de dos pasos, la desfosforilación enzimática y la descomposición del anión. La constante producción del anión y su lenta descomposición resultan en un delay del estado estacionario de la quimioluminiscencia (Bronstein et al, 1989) sostenido (casi constante) hasta por lo menos 1 hora. Figura 8

Dependencia del pH
El pH influye sobre la reacción catalizada por la enzima, ya que afecta la ionización de los grupos funcionales en los sitios activos de la enzima AP. La máxima emisión de luz quimioluminiscente – RLU (Relative light unit) – para este sistema se da a pH= 9 (Bronstein et al, 1989). Figura 9

Estabilidad térmica
Como se dijo anteriormente, la estabilidad térmica la da el grupo adamantano. El tiempo de vida media a pH=7 a 15ºC es de 675 horas y a 30ºC de 110 horas. Es un compuesto estable que se descompone muy poco cuando se lo almacena sólido a 5ºC.

Eficiencia quimioluminiscencia
Es más eficiente (3-400 x) cuando es protegido del “proton quenching” en soluciones proteicas (BSA) o surfactantes (CTAB).

Conclusiones
La quimioluminiscencia generada por catálisis de la fosfatasa alcalina sobre el sustrato AMPPD es ideal para sistemas de detección del tipo CLEIA debido a las características enumeradas en esta revisión.
La simplicidad y la sensibilidad de la lectura quimioluminiscente permiten el desarrollo de ensayos clínicos rápidos y precisos.
La intensidad de la señal es muy buena con bajo background (señal de fondo inespecífica) por lo que es posible generar un amplio rango de medición, ideal para aplicaciones en determinaciones de hormonas, marcadores tumorales y enfermedades infecciosas.


Imagen: Adaptado de http://www.l4labs.soton.ac.uk/

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