Desarrollo del T. cruzi DNA test

 Dr. Santiago Bortolotti
santiago.bortolotti@wiener-lab.com
Centro de Investigación y Biotecnología – Wiener Laboratorios SAIC, Rosario – Argentina


La enfermedad de Chagas (tripanosomiasis americana), es una infección causada por el parásito Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Es una causa importante de morbilidad y mortalidad en América Latina, generando entre 13.000 y 45.000 muertes de pacientes infectados por año. Si bien la infección se transmite principalmente por vectores hematófagos, otra vía de
transmisión importante es la transmisión congénita de la madre al feto.

El diagnóstico de laboratorio depende del estadio de la enfermedad. Durante la fase aguda, debido a que se presenta en general una alta parasitemia, el diagnóstico se efectúa mediante métodos parasitológicos directos o moleculares. Uno de los métodos directos más utilizados es la técnica del Microhematocrito (MH). Sin embargo, esta metodología es altamente dependiente del operador y presenta baja sensibilidad (alrededor de 50%). Los métodos moleculares se están incorporando a la rutina para detección en fase temprana de la enfermedad de Chagas (antes de los 10 meses). Uno de los métodos moleculares más aceptados para el diagnóstico de rutina en general es la reacción en cadena de la polimerasa, y en particular la PCR en tiempo real, la cual presenta elevada sensibilidad diagnóstica. Durante la fase crónica, se utilizan métodos serológicos como: ensayo inmunoenzimático, hemaglutinación o inmunofluorescencia. El diagnóstico temprano permite tomar decisiones terapéuticas de mayor éxito, ya que se ha demostrado que cuanto más temprano se suministre tratamiento tripanosomicida a un niño infectado, más
pronto se logra la seroconversión, actual criterio consenso de curación.

El producto “T. cruzi DNA Test” desarrollado en Wiener lab. resuelve la necesidad de mejorar el diagnóstico temprano de la infección por T. cruzi por vía transplacentaria, causante de la enfermedad de Chagas congénito mediante un sistema para diagnóstico molecular estandarizado dirigido al análisis de muestras de sangre de bebés recién nacidos de mujeres chagásicas. Se puede así contar con un método más sensible antes de los 10 meses en reemplazo del microhematocrito, permitiendo iniciar tempranamente tratamiento
tripanomicida a un niño infectado, mejorando la tolerancia (menores efectos adversos) y la efectividad del fármaco y su posibilidad de cura parasitológica.

T. cruzi DNA Test” fue el resultado final del desarrollo de un proyecto llevado a cabo a partir de la consolidación de un consorcio asociativo público-privado integrado por dos instituciones científicas nacionales: el Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas del Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (LaBMECh-INGEBI-CONICET), el Instituto Nacional de Parasitología Dr. Mario Fatala Chabén (INP, dependiente de la ANLIS) y por Wiener Laboratorios S.A.I.C. Parte de este proyecto incluyó la validación clínica del diagnóstico temprano mediante un estudio poblacional prospectivo con muestras de sangre de más de 500 bebés nacidos de mujeres infectadas, en muestras colectadas en maternidades de distintas provincias de zonas endémicas de nuestro país. Se realizó un seguimiento de pacientes al nacimiento, 2-3 meses y a los 10 meses de vida, comparando con el método de referencia (microhematocrito) en el marco del algoritmo vigente en el sistema de salud para Chagas de nuestro país. Este trabajo fue realizado por el Instituto de Efectividad Clínica y Sanitaria (IECS) y el análisis estadístico de los datos obtenidos a partir de este estudio, se está completando en la actualidad.

Fundamentos del método
El método se basa en una prueba de amplificación/detección simultánea de secuencias de ADN específico de Trypanosoma  cruzi y de un control interno, en ADN genómico extraído previamente de sangre humana mediante el uso de sondas específicas (probes) tipo TaqMan®. El producto amplificado se detecta a través de marcadores fluorescentes específicos diseñados para detectar todos los genotipos relevantes del parásito. La fluorescencia emitida durante la amplificación del ADN hace posible su detección y cuantificación mediante un instrumento de PCR en tiempo real.

El producto desarrollado comprende un sistema de amplificación/detección de ADN de T. cruzi conteniendo una mezcla de reacción (mastermix), un control positivo, un control interno (para agregar en la extracción de ADN) y agua libre de nucleasas. La mastermix desarrollada es única en su tipo con un formato líquido, listo para usar, que es estable en heladera y freezer. Esta mastermix contiene todos los componentes necesarios para la amplificación y detección simultánea (en 2 canales) del ADN del parásito T. cruzi y de un control interno (para asegurar la discriminación de eventuales falsos negativos). Además, su formulación cuenta con un sistema de protección y eliminación de contaminación por amplificaciones previas (uracil ADN glicosilasa), evitando resultados falsos positivos, una problemática común en ensayos reiterados de la misma amplificación en la rutina del laboratorio. El control positivo de T. cruzi se utiliza para correr controles de amplificación fuerte y débil en cada prueba. El control positivo en ambos niveles sirve como control de una adecuada amplificación e integridad de reactivos. El control positivo débil además, al estar en la zona del límite de detección de la prueba, asegura la adecuada sensibilidad del sistema. La inclusión de un control negativo de reacción sirve para confirmar la ausencia de contaminación de los reactivos. La menor cantidad de reactivos a emplear, simplifica y agiliza la tarea del usuario con menor riesgo de contaminación y errores de pipeteo por manipulación.

Este sistema también permite contar con resultados cuantitativos realizando un  curva estándar con un control positivo, en el caso de requerir determinar la carga parasitaria.

Características del kit para detección de ADN de T. cruzi:
* Tecnología robusta.
* Rapidez en la obtención de los resultados.
* Mayor reproducibilidad y confiabilidad en los resultados.
* Resultados cualitativos o cuantitativos.
* Reactivos estandarizados y estables.
* Mastermix líquida lista para usar y controles liofilizados.
* Contiene sistema de eliminación de contaminación de amplificaciones previas
(enzima uracil ADN glicosilasa).
* Controles de proceso completo (detección de falsos negativos por presencia de inhibidores o pérdida de ADN).
* Fácil de usar. (Menor manipulación:
menor riesgo de contaminación y errores de pipeteo).
* Compatible con diferentes termocicladores de real time PCR.

Performance del kit
Sensibilidad: LOD: 0,148 parásitos/ml
Linealidad: 1 – >105 parásitos/ml
Precisión: %CVintra ensayo: 12,47-21,53 y %CVtotal: 16,45-27,88 en la zona del
LOQ.
Especificidad Analítica: detecta todas las UDT´s (I-VI) de T. cruzi que infectan a seres humanos (Inclusividad). No detecta Trypanosoma rangeli ni Leishmania sp (Reactividad cruzada).
Estabilidad: 12 meses a 2-10ºC o -20ºC

Este kit de diagnóstico molecular emplea una técnica robusta y ampliamente difundida como es la PCR en tiempo real. Permite trabajar con un mayor número de muestras en menor tiempo (mayor rapidez) con resultados confiables y reproducibles. Este sistema se podría emplear también con otros pacientes agudos (infectados por vector, infecciones orales, transfundidos, trasplantados, transmisión accidental en laboratorio). Este grupo de individuos se caracterizan por niveles de parasitemia mucho mayor que en individuos con infecciones crónicas

Hasta el momento, es el único sistema con reactivos estandarizados en el mercado, validado clínicamente para la identificación de ADN de T. cruzi en niños recién nacidos de madres infectadas (transmisión congénita). Su mayor sensibilidad permitirá diagnosticar tempranamente la enfermedad de Chagas en mayor número de recién nacidos y niños, incrementando la posibilidad de curación de los mismos con un enorme impacto en la salud pública.

 

Deja tu comentario