Evolución del diagnóstico molecular

Lic. Diego Liosi
diego.liosi@wiener-lab.com
Centro de Investigación y Biotecnología – Wiener Laboratorios SAIC, Rosario – Argentina


El diagnóstico molecular es la utilización de técnicas de biología molecular en la detección de enfermedades infecciosas, genéticas, neoplásicas o en la identificación de individuos; permitiendo tanto diagnosticar como monitorear estas patologías. Esta combinación del laboratorio bioquímico con los conocimientos y las tecnologías de la biología molecular, ha
revolucionado el diagnóstico en las últimas décadas.

El inicio del Diagnóstico Mol cular se remonta al año 1949, cuando Pauling y sus colegas introdujeron el término molecular disease (enfermedad molecular) en el vocabulario médico, basándose en el descubrimiento de que un solo cambio de aminoácidos en la cadena de la β-globina conduce a la anemia de células falciformes. Aunque en ese momento la prestación de servicios de diagnóstico molecular era inconcebible y técnicamente imposible, sus hallazgos sentaron las bases del diagnóstico molecular.

En los años setenta, la revolución del ADN recombinante proporcionó el conocimiento básico sobre la secuencia primaria de varios genes. Se desarrollaron sondas de ADN para el análisis de regiones genómicas a través de Southern Blot, lo que permitió también desarrollar otra técnica como RFLP (del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism) para rastrear un alelo mutante de padres heterocigotos en un embarazo de alto riesgo. En 1976, Kan y sus colegas llevaron a cabo por primera vez el diagnóstico prenatal de la α-talasemia, utilizando hibridación en ADN aislado de fibroblastos fetales. Además, Kan y Dozy en 1978 implementaron el análisis de RFLP para localizar los alelos de células falciformes de origen africano; este avance proporcionó los medios para establecer enfoques diagnósticos similares para la caracterización de otras enfermedades genéticas, tales como la fenilcetonuria en 1983 y la fibrosis quística en 1986.

A mediados de la década de los ochenta, en los Estados Unidos, los ensayos de hibridación por Southern Blot eran una parte importante de los laboratorios de diagnóstico molecular para aplicaciones tales como la detección de deleciones de genes en la distrofia muscular de Duchenne y Becker y repeticiones en el Síndrome X Frágil. Las alteraciones estructurales podrían detectarse fácilmente mediante tecnologías de transferencia, y los ensayos de Southern Blot se convirtieron en el Gold Standard para detectar reordenamientos como por ejemplo el de los genes de las cadenas pesada y liviana de las inmunoglobulinas. Del mismo modo, los patógenos de enfermedades infecciosas podrían
detectarse en muestras clínicas con una mayor sensibilidad y especificidad que la mayoría de los métodos microbiológicos tradicionales. Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae fueron los primeros organismos que se pudieron detectar. En esta época los laboratorios comenzaban a percibir las limitaciones de estas técnicas respecto a sensibilidad, tiempo necesario para la técnica y las largas horas de dedicación que el personal del laboratorio requería para llevarlas a cabo. El hito disruptivo se dio a principios de los noventa, cuando se transfirió del laboratorio de investigación al laboratorio
clínico, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El descubrimiento de la PCR a mediados de los ochenta y su rápida optimización, utilizando una Taq ADN polimerasa termoestable de Thermus aquaticus, facilitaron y revolucionaron el diagnóstico molecular. En ese entonces, muchos laboratorios estaban en proceso o ya habían validado el uso de la PCR para aplicaciones específicas de diagnóstico clínico. La característica más poderosa
de esta técnica era la gran cantidad de copias de la secuencia target generada por su amplificación exponencial, permitiendo su detección cualitativa. Debido a la naturaleza del proceso de amplificación y a la sensibilidad y especificidad de estas reacciones para las dianas genómicas y microbianas, las pruebas con esta tecnología fueron incomparables respecto a otras utilizadas en los laboratorios clínicos de aquella época. La PCR fue una
potente herramienta que permitió la amplificación de secuencias específicas de pequeño tamaño, que luego podrían analizarse usando una variedad de métodos. En el caso de las mutaciones, al igual que con las tecnologías de transferencia de Southern Blot, los productos de PCR podían ser evaluados mediante el uso de endonucleasas de restricción que cortaban o no un producto de PCR, dependiendo de si la mutación contenía o no el sitio de reconocimiento de la enzima. Sin embargo, presentaba algunas limitaciones como ser deficiencia en las estimaciones cuantitativas, la necesidad de contar con controles
de contaminación física y química, y el hecho de que el proceso de detección post-PCR a menudo tomaba más tiempo que la propia amplificación.

La epidemia de VIH-1 causó un impacto médico y económico significativo en el mundo, para ese entonces la terapia combinada resultó ser eficaz, generando la necesidad de un método que permitiese controlar el éxito o fracaso del tratamiento en sus pacientes. La capacidad de cuantificar la cantidad de virus en una muestra de paciente se logró mediante un ensayo de carga viral de VIH-1, por medio de la tecnología de Branched DNA testing (bDNA), que fue capaz de cuantificar con exactitud el virus en el plasma del paciente. Luego, comenzaron a aparecer pruebas similares para el HCV, HBV y CMV, entre otros.

A finales de los años noventa, el campo del diagnóstico molecular estuvo dominado por nuevos desarrollos, tanto para la detección cualitativa como cuantitativa de agentes infecciosos. Si bien la PCR continuó siendo la tecnología elegida, se implementaron numerosos desarrollos para simplificar la detección de productos de PCR. La introducción de instrumentos semiautomáticos para pruebas de enfermedades infecciosas de alto volumen fue sólo una parte de este proceso.

A principios de la década pasada, las tecnologías aún necesitaban adaptarse al día a día de un laboratorio clínico; se necesitaban modificaciones a la PCR para que la amplificación y la detección ocurrieran simultáneamente. Con el tiempo, esto llevó al desarrollo de la PCR en tiempo real. Esta innovación dio lugar a tiempos de trabajo más cortos para las pruebas moleculares, haciendo posible el análisis sin necesidad de lotes de muestras, procesando
y probando los especímenes a medida que llegaban al laboratorio. Hoy en día existen pruebas de volumen más pequeño para enfermedades infecciosas, oncológicas y genéticas que pueden realizarse sobre un sistema de acceso aleatorio (multiplex para diferentes tipos de muestras en una única plataforma). Además, la PCR en tiempo real ofrece la capacidad de proporcionar de manera más fácil estimaciones cuantitativas de las dianas virales. La conversión de las plataformas de PCR tradicionales a las PCR en tiempo real, generó que el principal impedimento en los laboratorios para el tiempo de respuesta
fuera el procesamiento de muestras, ya que la mayoría de las pruebas moleculares ya no requerían un excesivo trabajo de los profesionales.

En los últimos años, la elevada demanda de secuenciación de bajo costo ha dado lugar a distintas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento que son capaces de paralelizar muchas operaciones de secuenciación, reduciendo así los costos. Éstas son las llamadas “Next-Generation Sequencing (NGS)”, y aún no se ha podido  imensionar cual será el impacto de dichas tecnologías en el diagnóstico molecular; sin embargo su irrupción tal vez provoque un cambio de paradigma similar al que causó la PCR.

Desde 1949 a la actualidad, el diagnóstico molecular ha sufrido grandes revoluciones, pasando de ser técnicas manuales, poco sensibles y lentas, a la introducción de sistemas totalmente automatizados, rápidos y con baja carga de trabajo. El desarrollo de su potencial parece aún estar lejos de haber llegado a su fin, técnicas como NGS, PCR en tiempo real, LAMP y bioinformática marcan el camino de un futuro prometedor.


Imagen adaptada de: https://mi.inta.cl

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