Micropartículas circulantes

Bioq. Carina Tallano
carina.tallano@wiener-lab.com
Centro de Investigación y Biotecnología – Wiener Laboratorios SAIC, Rosario – Argentina


Introducción

Durante los últimos años, estudios han revelado que las Micropartículas (MPs) constituyen estructuras especializadas de la comunicación intercelular. Poseen un rol importante en los procesos celulares fisiológicos y patológicos, vinculándose al inicio, desarrollo y progresión de enfermedades cardiovasculares, inflamatorias, autoinmunes, etc.
Las MPs fueron descriptas por primera vez por Wolf en 1967 como “restos plaquetarios”. Consideradas como materiales inertes en aquel tiempo, hoy son reconocidas como entidades biológicamente activas que representan una materia importante de investigación como biomarcadores de diferentes condiciones patológicas.

Micropartículas – clasificación y formación

Las Microparticulas circulantes (MPs) son una población heterogénea de vesículas extracelulares derivadas de membrana con un tamaño de 0.1 a 1 μm de diámetro. La biogénesis de las MPs es uno de los principales factores que las distingue de los otros grupos de vesículas membranosas: los exosomas y los cuerpos de apoptosis (ver Tabla 1).
Las MPs son liberadas de la membrana celular por estímulos físicos (hipoxia, shear stress) o estímulos químicos (citoquinas, trombina, endotoxinas) durante fenómenos de activación o apoptosis celular. Se originan a partir de plaquetas, células endoteliales, monocitos, macrófagos, eritrocitos, adipocitos, células del sistema nervioso central, células neoplásicas, etc.
Cuando la célula recibe un estímulo específico, el aumento de calcio citosólico activa un complejo sistema enzimático formado por flipasas, flopasas y escramblasas, que controla la asimetría de membrana. Esta activación conduce a un pasaje de fosfatidilserina (PS) y fosfatidiletanolamina (PE) a la capa externa de la membrana plasmática. En un proceso complejo que implica la participación de enzimas como calpaínas, caspasas, transglutaminasas y quinasas se reorganiza el citoesqueleto con la aparición de protuberancias en la membrana que llevan a la generación de MPs. Existe evidencia que estas vesículas membranosas podrían generarse selectivamente en dominios ricos en lípidos dentro de la membrana plasmática. Las MPs circulantes conservan las proteínas de membrana y el contenido citosólico de la célula progenitora. Estas proteínas son antígenos constitutivos que permiten identificar su origen celular. Además, las MPs exponen en su superficie moléculas funcionales que han sido inducidas por estímulos de activación o apoptosis en la célula progenitora. Es probable que tanto el origen como la naturaleza del estímulo, influyan en el número y el fenotipo de las MPs generadas y por lo tanto, en sus funciones y efectos fisiopatológicos.

Características de las vesículas membranosas extracelulares

Tabla 1: Dentro de las vesículas extracelulares derivadas de membrana encontramos a los exosomas, Micropartículas (MPs) y cuerpos de apoptosis. Estos grupos poseen diferencias en tamaño, origen, propiedades estructurales y bioquímicas, lo cual determina la función y el rol que cumplen en los sistemas biológicos en los que participan.

Efectos biológicos medidos por micropartículas

Las MPs cumplen un rol activo en la comunicación entre células, regulando un gran número de procesos fisiológicos. Dentro de los efectos biológicos más caracterizados y estudiados encontramos:

Coagulación:
La propiedad más indiscutida de las MPs es su potencial procoagulante. Probablemente, este rol activo en procesos de la coagulación explique el incremento de MPs en desórdenes de hipercoagulabilidad de la sangre. Su actividad procoagulante se debería a la exposición de fosfolípidos aniónicos, como la fosfatidilserina (PS), que actúan como una superficie de anclaje a los factores de coagulación, promoviendo la generación de trombina. Por otro lado, ciertas poblaciones de MPs exponen Factor Tisular (FT) en su superficie, que participa en la formación de un complejo con FVII/FVIIa, componente crítico en fases iniciales de la coagulación. La expresión de FT ha sido reportada en monocitos y células endoteliales, pero no así en plaquetas.

Mecanismo propuesto de generación de MPs sobre la membrana celular

Estrés oxidativo:
Las MPs regulan la producción de ROS (especies reactivas del oxígeno) en el endotelio. La mayoría de estudios sobre el tema sugieren que las MPs derivadas de células endoteliales, monocitos y linfocitos son capaces de promover el estrés oxidativo en el endotelio a través de procesos que involucran varios sistemas enzimáticos. Sin embargo, el efecto pro-oxidativo resultante dependerá del tipo de estímulo iniciador, de la clase de célula que genera las MPs y del sistema enzimático que sea afectado.

Inflamación:
Las MPs pueden ser parte de las causas y las consecuencias del proceso inflamatorio. Las MPs podrían promover inflamación en ausencia de microrganismos, este proceso sería considerado una forma de inflamación estéril, la cual involucra la producción de mediadores pro-inflamatorios y el reclutamiento de células inflamatorias. Además, se ha comprobado que las MPs promueven la interacción y adhesión de leucocitos a células endoteliales.
Su rol en la interacción entre células (plaqueta-plaqueta, plaqueta-leucocito o célula endotelial- leucocito), postula nuevos mecanismos para explicar la relación entre elementos celulares de la coagulación y de la inflamación.

Angiogénesis:
Las MPs están implicadas en la regulación de la angiogénesis. La primera población reportada por su capacidad promotora de angiogénesis fueron las MPs plaquetarias. En la actualidad, también se sabe que otras poblaciones de MPs poseen dicha capacidad.

Apoptosis:
Además de ser la apoptosis un estímulo potente de formación de MPs, también podría ser resultante de la señalización de las MPs. Durante la apoptosis, la formación de MPs es esencial para iniciar los fenómenos de inflamación y coagulación. Por otro lado, la generación de microvesículas como respuesta al estímulo apoptótico puede ser una forma de defensa de la célula contra el ataque del complemento, permitiendo la eliminación de estos complejos sub-letales dispuestos sobre su membrana.

Micropartículas y condiciones clínicas

Numerosas investigaciones han reportado la relación entre MPs y varias condiciones patológicas como infarto agudo de miocardio, accidente cerebro vascular, tromboembolismo venoso, síndrome antifosfolipídico, púrpura trombocitopénica trombótica, trombocitopenia inducida por heparina, anemia falciforme, sepsis, falla renal crónica, etc.
Estas indiscutidas asociaciones han llevado al estudio de las MPs como potenciales biomarcadores de utilidad clínica en la detección e identificación temprana de la patología, evaluación del riesgo e intervención terapéutica temprana de la enfermedad.

Métodos de estudio

La mayoría de estudios de investigación y clínicos en micropartículas han sido realizados en muestras de plasmas que poseen MPs derivadas de células en contacto con la sangre. Todas las células del organismo poseen una activa formación de MPs, sin embargo, es menor el conocimiento disponible de MPs generadas por otros tipos celulares, principalmente debido al difícil acceso a algunos de estos fluidos biológicos.
La preparación de la muestra de plasma es crítica en la calidad del resultado final. Existen varios protocolos basados en plasma libre en plaquetas (PFP) obtenido por centrifugación o filtración seriada del plasma citratado o alternativamente, otros protocolos que utilizan MPs lavadas obtenidas de la ultracentrifugación del PFP.
Existen varios métodos para la detección y caracterización de las MPs:

Citometría de Flujo:
Es uno de los métodos más comunes en el laboratorio para la identificación y cuantificación de MPs plasmáticas. Está basado en propiedades específicas de las MPs, como el tamaño y los biomarcadores de superficie. En la actualidad existen gran variedad de anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos para la identificación de un amplio espectro de MPs. A pesar de las limitaciones de sensibilidad para medir poblaciones de MPs de menor tamaño (<0.3 μm), la citometría de flujo continúa siendo en la actualidad el método Gold Standard para la medición de MPs.

Métodos de Captura:
Este método está basado en la captura de las MPs sobre una superficie (placa de ELISA) que contiene Anexina V o anticuerpos dirigidos a antígenos de membrana de las MPs. Las MPs capturadas son luego detectadas inmunológicamente a través de anticuerpos de detección (ELISA) o funcionalmente a través de su capacidad procoagulante. Este método no tiene restricciones por el tamaño de las MPs, es confiable y accesible para la mayoría de los laboratorios. Sin embargo, no discrimina si se han pegado otras vesículas membranosas a la superficie de captura, ni reconoce posibles modificaciones en la expresión relativa de antígenos de superficie que podrían impactar en la cuantificación de las MPs.
Por último, en la actualidad existen un grupo de métodos emergentes que proveen información sobre la fenotipificación de las MPs: microscopía electrónica, microscopía de fuerza atómica, dispersión dinámica de la luz (DLS) y NTA “nanoparticle tracking scattering”.
A pesar de los grandes avances metodológicos producidos en los últimos años, es importante remarcar que aún queda mucho trabajo por realizar sobre la estandarización y optimización de los protocolos de preparación y conservación de muestras, como así también en los métodos de detección y cuantificación de MPs.

Conclusiones

Consideradas originalmente como materiales inertes, en la actualidad las MPs son reconocidas por su rol activo en la modulación de una variedad de eventos celulares transportando información biológica e impactando en diferentes procesos fisiológicos.
La utilidad de las MPs circulantes en la práctica clínica de rutina se desarrollará e incrementará conjuntamente a los avances en la estandarización de todo el proceso diagnóstico. Estos logros, permitirán que las MPs emerjan como biomarcadores tempranos en la detección, progresión y monitoreo terapéutico de un gran número de enfermedades.

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