Anticuerpos monoclonales: pasado, presente y futuro

Rodrigo Fernández Bussy
rodrigo.bussy@wiener-lab.com
Centro de Investigación y Biotecnología – Wiener Laboratorios SAIC, Rosario – Argentina


Históricamente, la producción de anticuerpos implicaba inocular un animal con el antígeno de interés. De este modo, el antisuero obtenido contenía una población de moléculas de anticuerpos que reconocen diferentes epítopes del mismo antígeno.
Esta situación cambió a partir del trabajo publicado por el Dr. César Milstein sobre el desarrollo de la tecnología de hibridomas murinos para la producción de anticuerpos monoclonales; el cual le valió el “Premio Nobel en Fisiología o Medicina” en 1984. Los anticuerpos monoclonales (mAbs) consisten en una población de anticuerpos que reconocen el mismo epítope, producidos por células plasmáticas idénticas las cuales son clones derivados de una célula parental única. La generación de hibridomas, consiste en varias etapas:
1) Desarrollo del hibridoma:
– El primer paso implica inyectar un ratón con el antígeno de interés a fin de generar una respuesta inmune específica. A continuación, el animal produce células plasmáticas las cuales se extraen a partir del bazo del mismo. Sin embargo, las mismas se mueren rápidamente luego de ser extraídas del organismo ya que tienen un tiempo de vida media muy corto
– El segundo paso, consiste en convertir a las células plasmáticas obtenidas en células inmortales mediante fusión con células tumorales. Para esto se emplean células plasmáticas inmortales derivadas de mieloma múltiple, las cuales son incubadas con las células plasmáticas en presencia de polietilenglicol, el cual fusiona las membranas plasmáticas de células adyacentes. Este proceso fusiona las células creando células híbridas denominadas hibridomas, las cuales conservan la capacidad de producir anticuerpos específicos, pero también poseen las propiedades replicativas de las células tumorales.
2) Screening:
– A continuación, la mezcla de células son diluídas hasta lograr separarlas de manera individual y expandir los clones en pocillos de microplaca. Los anticuerpos producidos por los diferentes clones son evaluados mediante ELISA u otros métodos para determinar aquellas células que producen el anticuerpo de interés con la especificidad deseada. Una vez seleccionado el hibridoma de interés, el mismo es clonado a fin de establecer un clon estable, el cual es mantenido en cultivo para proveer un suministro continuo de anticuerpos.
3) Purificación
– Una vez obtenidos los cultivos de hibridomas, los anticuerpos deseados deben ser extraídos y purificados, lo cual puede realizarse mediante varias técnicas siendo la cromatografía por afinidad empleando proteína A/G la más frecuente.A pesar de este gran avance tecnológico, el uso de los mAbs en pacientes sufrió inconvenientes iniciales. Debido a que los hibridomas son de origen murino, los anticuerpos generados por estos son proteínas murinas, las cuales son reconocidas como cuerpos extraños por el sistema inmune humano. Por lo tanto, los pacientes tratados generaban anticuerpos anti-mAbs (HAMAs – Human Anti Murine Antibodies); limitando la efectividad de dichas drogas y generando serios efectos secundarios tales como alergias y shock anafiláctico. En vista a los efectos secundarios y limitaciones en el uso de mAbs mediante hibridomas murinos, se han desarrollado varias modificaciones y mejoras en la forma de producir mAbs. La figura 1 presenta de manera resumida los diferentes tipos de anticuerpos monoclonales desarrollados a la fecha.
4) Anticuerpos monoclonales quiméricos (AcQ)
Los anticuerpos Quiméricos (AcQ, identificados por el sufijo -ximab) son moléculas en donde las porciones constantes de la cadena pesada y liviana provienen de una inmunoglobulina (Ig) humana y las regiones variables pesada (VH) y variable liviana (VL) son obtenidas de un mAbs murino (Figura 2). El objetivo perseguido con la construcción de un AcQ es reducir la inmunogenicidad para el humano de los mAbs murinos, pero sin afectar la especificidad del anticuerpo. Su producción conlleva el mismo proceso de generación de hibridomas con la salvedad que, una vez generado el mismo, la zona del ADN codificante para la región constante del anticuerpo murino es reemplazado por su equivalente humano, a la vez que se conserva la región variable determinantes de la especificidad. La Figura 2 resume el proceso de obtención de AcQ.

Figura 1: Representación general del método para la obtención de anticuerpos monoclonales quiméricos

Anticuerpos monoclonales humanizados (AcH)
A pesar de las mejoras logradas, algunas moléculas quiméricas aún son capaces de inducir una respuesta inmune humoral cuando son administradas en humanos. Esa inmunogenicidad residual ha sido atribuida a la presencia de epítopes foráneos presentes en las Regiones Determinantes de la Complementariedad (CDRs) y en las regiones M de los dominios V del AcQ murino. Dicho inconveniente llevó al desarrollo de los anticuerpos monoclonales humanizados (AcH). Esta tecnología se basa en el supuesto de que el paratope se forma a partir de la combinación espacial de las asas hipervariables que corresponden a las CDRs, mientras que las regiones M solo actúan como andamios cuya única función es servir de soporte estructural para el epítope. Por lo tanto, las CDRs de un anticuerpo murino son genéticamente insertados en el contexto de regiones M humanas, formándose así una región V híbrida ratón-humano y confiriéndoles la especificidad deseada a una molécula que en el resto de su estructura es completamente humana.

Anticuerpos completamente humanos
La más reciente generación de anticuerpos monoclonales son nombrados anticuerpos completamente humanos. Existen dos posibilidades para la generación de anticuerpos humanos: empleando la tecnología de hibridomas o mediante la técnica de phage display, mucho más reciente.

Figura 2: Resumen de las diferentes tecnologías disponibles para producir diferentes tipos de anticuerpos monoclonales completos

Hibridomas
Dentro de la estrategia de hibridomas hay dos posibles alternativas. La primera es la generación de hibridomas humanos. Esta tecnología experimentalmente muy difícil, depende de la disponibilidad de linfocitos B de, por ejemplo, pacientes infectados o inmunizados con el antígeno de interés. Por lo tanto, también está restringido su uso por razones éticas. La segunda alternativa es muy similar al proceso de generación de hibridomas murinos con la diferencia de que los animales empleados han sido genéticamente modificados y poseen el loci para Igs humanas en vez del loci para Igs murinas. Por lo tanto y luego de la inmunización, estos animales transgénicos producen anticuerpos completamente humanos. A nivel terapéutico, estos anticuerpos reducen significativamente los efectos secundarios observados con el empleo de los AcQ y AcH.

Phage Display
La invención de la técnica de phage display revolucionó el desarrollo de los anticuerpos como drogas terapéuticas y diagnósticas. Esta técnica emplea métodos de biología molecular buscando identificar y amplificar los CDRs óptimos en los genes de las cadenas pesadas y livianas mediante PCR y sintetizar dichas cadenas en sistemas bacterianos o eucariotas mediante tecnología recombinante.
De manera resumida, la técnica de phage display consiste de las siguientes etapas:
1) INSERCIÓN GÉNICA: Esta etapa consiste en la inserción de nuevo material genético en el genoma de un fago filamentoso. Esta etapa se inicia al aislar linfocitos B de la sangre de humanos o ratones para luego purificar el mRNA y obtener el cDNA mediante RT-PCR de modo de amplificar todos los segmentos variables VH y VL. Estos segmentos son luego clonados en un fásmido, próximos al gen codificante para una proteína de cubierta del bacteriófago para ser luego empleado en la infección de Escherichia coli. Al emplear un fásmido como vector, no habrá liberación de partículas fágicas a menos que E. coli sea co-infectada con un fago helper el cual permite el empaquetamiento del DNA del fago y el ensamblado de viriones maduros. Es decir, que en este paso se inserta un conjunto diverso de genes dentro del genoma de la población de fagos, donde cada fago individual recibe un solo constructo génico particular.
2) PROTEIN DISPLAY (Exposición de proteínas): A continuación, bacterias E. coli infectadas pueden liberar bacteriófagos que contienen los segmentos CDRs VH y VL como parte de su cubierta, donde cada fago que recibió un único constructo génico, expresa un único tipo de proteína exógena sobre su superficie. Es decir, que en este punto se dispone de una biblioteca de fagos donde cada uno tiene un gen diferente y expresa una proteína diferente en su superficie (1010 células).
3) UNIÓN Y SELECCIÓN (Figura 3): A continuación, esta biblioteca de fagos se presenta ante una molécula de interés inmovilizada en pocillos de microplaca, por ejemplo, de modo que solo los fagos que expresen en su superficie un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que reconoce específicamente a la molécula inmovilizada serán seleccionados. Se realiza un lavado a fin de remover los fagos que no se unen y se repite este proceso varias veces para asegurar seleccionar únicamente los fagos que presenten una unión específica. A continuación, los fagos de interés pueden ser eluidos, aislados y el gen de la proteína expuesta secuenciado para que finalmente sea clonado dentro de un andamio genético para anticuerpos humanos completos o su expresión como fragmentos de anticuerpos.
La principal ventaja de esta metodología incluye que, una vez generada la biblioteca de fagos, la misma puede ser empleada para generar nuevos anticuerpos. Asimismo, el proceso de obtención de anticuerpos es mucho más rápido que el método por hibridomas. Otra ventaja es que no se requiere ningún paso de inmunización, ya que todo el proceso se realiza in vitro y, además, permite obtener anticuerpos contra sustancias tóxicas las cuales no pueden ser inoculadas en animales. Asimismo, la selección in vitro permite modificar las condiciones de la selección para que se condigan con las condiciones finales de la aplicación del anticuerpo (pH, composición del buffer, temperatura, etc.). Finalmente, se debe nombrar que la técnica permite obtener la secuencia codificante del anticuerpo, de modo que, si se pierde el clon, se puede sintetizar nuevamente la secuencia nucleotídica sin perder todo el trabajo realizado.

Figura 3: Unión, lavado y elusión durante el proceso de screening

Fragmentos de anticuerpos recombinantes (AcR) desarrollados mediante Phage Display
Mientras que la expresión de anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos es más fácil en células eucariotas, E. coli demostró ser un sistema excelente para la expresión de fragmentos de anticuerpos (AcR – Anticuerpos Recombinantes). Asimismo, se ha demostrado que la expresión en el espacio periplasmático de bacteria permite producir moléculas activas en un pequeño volumen y en un compartimiento subcelular relativamente libre de enzimas proteolíticas activas.
Existen dos tipos de fragmentos con la capacidad de unirse al antígeno, éstos son los Fragmentos Variables (Fv) y los Fragmentos de Unión a Antígenos (Fab). Se ha desarrollado una versión recombinante del fragmento Fv en la que los dominios VH y VL se encuentran unidos físicamente a través de un linker peptídico, pequeño y flexible. Este linker de 15 aminoácidos tiene la longitud y flexibilidad necesaria para permitir el arreglo espacial adecuado de los dominios VH y VL generando un Fv funcional mediante interacciones no covalentes (Figura 4). Tales construcciones han sido denominadas Fragmentos Variables de Cadena Simple (scFv – Single Chain Variable Fragments); los cuales son más estables que los Fv convencionales y conservan la capacidad de reconocer y ligar antígenos. Además de estas moléculas, también se han desarrollado moléculas bivalentes. Esta estrategia se basa en el scFv ya descripto, solo que la longitud del linker es menor en comparación a la scFv original. Esta reducción del linker a tan solo 5 aminoácidos imposibilita la formación de un Fv funcional entre dos dominios VH y VL en una misma molécula. Ello conduce a la interacción de dos moléculas scFv, formándose un dímero (Figura 4), el cual posee dos sitios de combinación con el antígeno. Si la especificidad de los dominios VH y VL es la misma, el producto obtenido es un homodímero bivalente conocido como diabody. Empleando el mismo formato, es posible producir moléculas recombinantes con dos especificidades diferentes, para lo cual se diseñan dos construcciones tipo scFv diferentes (Figura 4). De forma similar a como ocurre con los diabodies, los polipéptidos producidos a partir de estas construcciones son incapaces de formar scFv funcionales de manera individual. No obstante, sí son capaces de aparearse apropiadamente para generar heterodímeros en donde ambas especificidades A y B son restauradas y se encuentran físicamente asociadas. Estas moléculas han sido nombradas como anticuerpos biespecíficos. Si el péptido linker es eliminado completamente y ambas regiones expresadas como un polipéptido continuo, entonces, el resultado es la formación de un trímero funcional con capacidad para ligar tres determinantes antigénicos. Estos fragmentos han sido denominados triabodies (Figura 4). Finalmente, otro tipo de fragmento recombinante desarrollado es el minibody o Proteína Inmune Pequeña (SIP – Small ImmuneProtein). Esta construcción es una variante del scFv en el que un dominio CH3 está asociado físicamente, en una misma cadena polipeptídica a un scFv a través de un linker que contiene residuos de cisteína en su secuencia para la formación de puentes disulfuro (Figura 4). Se ha observado que estos minibodies presentan excelentes propiedades farmacocinéticas.
Una ventaja de los AcR sobre los anticuerpos de tamaño completo es que los AcR son lo suficientemente pequeños como para infiltrarse en algunos tejidos en los cuales los anticuerpos de tamaño completo no pueden penetrar, lo cual ayuda tanto en procedimientos terapéuticos como inmunohistoquímicos. Los AcR son más pequeños y carecen de glicosilación, permitiendo su producción en sistemas de expresión procariotas, lo que permite ahorrar tiempo y costos. Sin embargo, una desventaja importante es que no tienen un gran efecto terapéutico ya que al no contar con el dominio Fc no desencadenan todas las funciones dependientes de la interacción Fc-Receptor de Fc.
Con todo lo descripto anteriormente, resulta claro que nos encontramos dentro de un nuevo paradigma de producción de anticuerpos monoclonales, donde una nueva generación de moléculas de reconocimiento específicas para antígenos está entrando en la cresta de la ola.

Figura 4: A) La molécula de anticuerpo y sus diferentes regiones. B) Construcciones génicas y los diferentes fragmentos recombinantes de anticuerpos generados a la fecha. Fab: Fragmento de unión a antígeno, Fv: Fragmento Variable, Fc: Fragmento Cristalizable, VL: Región variable de cadena liviana, VH: Región variable de cadena pesada, CL: Región constante de cadena liviana, CH: Región constante de cadena pesada