Interferencia de biotina en inmunoensayos: qué debemos saber para disminuir riesgos

Dra Claudia Elena
claudia.elena@wiener-lab.com

Product Team – Wiener Laboratorios SAIC, Rosario – Argentina


Biotina

La biotina, también denominada B7, es una vitamina hidrosoluble del complejo B. Es una molécula pequeña de 244,31 Da que actúa como un co-factor esencial en reacciones enzimáticas de carboxilación, por lo que tiene un rol importantísimo en el metabolismo de ácidos grasos y de aminoácidos de cadena ramificada, gluconeogénesis y en el ciclo de Krebs.
La biotina está ampliamente distribuida en alimentos, principalmente en la yema de huevo, en el hígado y en algunos vegetales. La ingesta diaria de biotina es de 5 μg/día en recién nacidos, aumentando gradualmente a 30 μg/día en adultos. En individuos normales, las concentraciones séricas de biotina son bajas, entre 0,1-0,8 ng/ml. Sin embargo, la suplementación de biotina exógena ya sea en tratamientos farmacológicos o bien, como parte de complejos multivitamínicos, en creciente uso en la actualidad especialmente asociados a tratamientos para fortalecer uñas y cabellos, pueden llevar a un incremento de la “biotina exógena” disponible y consecuentemente a un mayor riesgo de interferencia en los inmunoensayos.

Sistema Biotina-(Estrept)avidina

El sistema Biotina-(Estrept)avidina es utilizado en más del 50% de los distintos inmunoensayos actualmente disponibles para fijar los inmunocomplejos formados por la reacción antígeno-anticuerpo a la fase sólida, de manera de hacer factible la separación entre la fracción libre y la fracción unida en los pasos posteriores de lavados. Al tratarse de una molécula pequeña, la biotina se puede acoplar a través de uniones covalentes a proteínas, polipéptidos y agentes de bajo peso molecular, sin alterar significativamente sus propiedades biológicas, enzimáticas o inmunorreactivas. El segundo componente del sistema (estrept)avidina está constituido por dos proteínas: la avidina, que es una glicoproteína básica (pI 10) de 67 kDa (presente en la clara de huevo); y la estreptavidina, una proteína de 66 kDa, desprovista de carbohidratos, discretamente ácida (pI 5-6), y producida por Streptomyces avidinii. Tanto la avidina como la estreptavidina presentan cuatro sitios de ligación, interaccionando con la biotina por medio de uniones no covalentes de alta especificidad y afinidad. La constante de asociación de la reacción es muy elevada, de alrededor de 1015 L/mol; o sea, 103 a 106 veces mayor que la constante de asociación entre un antígeno/anticuerpo, siendo considerada una de las uniones más fuertes entre una proteína y su ligando. Es por esto, que una vez formado el complejo no es afectado por cambios de pH, interferentes o lavados sucesivos en el tubo de reacción. Como la avidina tiene mayores reacciones inespecíficas producto de su pI alto y de la presencia de carbohidratos en la molécula, esta fue sustituida por la estreptavidina en la mayoría de los inmunoensayos.
La estrategia más frecuentemente utilizada es fijar la molécula de estreptavidina a la fase sólida (en general, micropartículas paramagnéticas o soporte de plástico) durante la confección del kit por parte del fabricante. En ese caso, los anticuerpos o antígenos biotinilados reaccionan con la muestra, formando inmunocomplejos que se fijan a la fase sólida a través de la interacción biotina-estreptavidina. Otra estrategia menos utilizada consiste en acoplar durante la fabricación del kit, tanto la estreptavidina a la fase sólida como el antígeno o anticuerpo biotinilado, de manera de que la interacción entre biotina-estreptavidina ocurra antes de la incubación con la muestra. La primera estrategia es la más comúnmente utilizada y diversas sustancias que puedan estar presentes en la muestra, como la biotina exógena, pueden interferir en la fijación de los inmunocomplejos a la fase sólida, mientras que en el segundo caso esta situación no ocurre. Existe también un número menor de casos en que la estreptavidina es sustituida por anticuerpos anti-biotina, siendo susceptibles al mismo tipo de interferencia de biotina exógena dependiendo del formato del ensayo.

Figura 1A y 1B: En inmunoensayos basados en el sistema biotina-estreptavidina, la interferencia por biotina exógena inhibe la fijación de los inmunocomplejos generados a la fase sólida, lo que conduce a una disminución de la señal generada provocando valores falsamente aumentados o disminuidos, según se trate de inmunoensayos de formato competitivos (A) o de tipo sándwich (B), respectivamente.

Interferencia por biotina en inmunoensayos

El potencial de interferencia por biotina es grande ya que diversos inmunoensayos ampliamente utilizados en el laboratorio clínico para medir una serie de analitos, tales como hormonas, marcadores cardíacos, marcadores tumorales, marcadores de anemia y en pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas, utilizan el sistema biotina-estreptavidina. Cualquiera de estos inmunoensayos, independientemente del fabricante, están sujetos a la interferencia por biotina dependiendo de la dosis ingerida, del formato y de la susceptibilidad del método.
En estos casos, la biotina exógena interfiere inhibiendo la unión de los inmunocomplejos a la fase sólida. Estos complejos permanecen libres en solución y eventualmente pueden ser eliminados en los sucesivos pasos de lavado del método. Con esto, una parte de antígeno o anticuerpo conjugado marcado se pierde en este proceso, afectando la señal generada al final de la reacción.
En la figura 1(A) se ilustra la interferencia de biotina exógena en inmunoensayos competitivos. En este formato de inmunoensayos, dado que la señal generada es inversamente proporcional a la concentración del analito, una menor señal resulta en un valor falsamente aumentado del analito en cuestión. En el caso de inmunoensayos de tipo “sándwich” o indirectos (figura 1B), la presencia de biotina en exceso inhibe la formación de los complejos biotinilados con la estreptavidina; estos son eliminados durante los procesos de lavado del método, lo que resulta en una menor señal generada, y, por ende, en un valor falsamente disminuido del analito en cuestión.

Riesgos de interferencia de biotina según su uso 

En general, la cantidad de biotina presente en la dieta normal y en la mayor parte de los multivitamínicos (30-60 μg /día) no interfieren en los inmunoensayos. Recién a partir de dosis mayores a 1 mg/día pueden comenzar a aparecer alteraciones laboratoriales, y es en este punto donde podemos describir dos poblaciones diferentes. Por un lado, los tratamientos farmacológicos con suplementación de biotina exógena en pacientes con enfermedades metabólicas, esclerosis múltiple, malabsorción o en pacientes con nutrición parenteral. Si bien en estos casos la dosis ingerida puede llegar hasta 300 mg/día, lo que representa entre 2000 a 6000 veces la ingesta diaria normal, esto se da en un número muy reducido de casos que precisan de prescripción médica y por esto, este grupo de pacientes puede ser reconocidos durante la etapa pre-analítica al ser consultados sobre la ingesta de algún tipo de medicación.
Por otro lado, tenemos el grupo de pacientes que utilizan suplementos de biotina para el fortalecimiento de uñas y cabellos, de creciente uso en la actualidad, y tienen una ingesta diaria comprendida entre los 5-10 mg. Estos complejos vitamínicos son de venta libre y generalmente no son referidos o mencionados al momento de la consulta en la etapa pre-analítica. Estas dosis de biotina exógena constituyen un incremento de 125 veces en comparación con la ingesta de biotina en la dieta normal. Estudios farmacocinéticos describen que en estas dosis de 5mg/día y 10 mg/día, la concentración de biotina en suero cae por debajo de los 30 ng/mL a las 3,5 y 8 horas, respectivamente, por lo que no tendrían un impacto significativo como interferencia en los inmunoensayos evaluados, si la toma de muestra se realiza luego de estos tiempos.

Estrategias para minimizar la interferencia analítica por biotina 

Dentro de las medidas simples que se pueden adoptar para minimizar la interferencia por biotina, podemos considerar:
• Adjuntar información sobre biotina en las instrucciones de preparación para los exámenes de laboratorio que sean susceptibles a este interferente y consultar a los pacientes sobre el uso de biotina durante la fase pre-analítica. En muchos casos al formar parte de complejos multivitamínicos y no ser considerado como un medicamento en sí, frecuentemente su consumo o ingesta no es reportado al médico o al laboratorio.
• Si es posible, recomendar la suspensión de ingesta de biotina antes de realizar la toma de muestra. La recomendación general es que en pacientes en tratamiento con dosis elevadas de biotina (>5 mg/día), la toma de muestra se realice como mínimo 8 horas después de la última dosis.
• En muestras que presenten resultados sospechosos, se debería repetir el análisis utilizando métodos que no utilicen el sistema biotina-estreptavidina. En algunos casos, el laboratorio puede “neutralizar” el efecto de biotina preincubando las muestras con una solución de micropartículas magnéticas revestidas con estreptavidina. Luego las micropartículas son separadas por centrifugación o por medio de un imán o magneto, y el sobrenadante recuperado puede ser procesado sin afectar la disponibilidad del analito a medir. Este procedimiento permite identificar y remover la interferencia analítica por biotina en pacientes que tomen altas dosis de este suplemento sin reducir la precisión y la exactitud del ensayo.
• Mantener el dialogo constante con el equipo médico, con el fin de facilitar el reporte de resultados incompatibles con el cuadro clínico del paciente, de manera de revisar posibles interferentes en el método diagnóstico utilizado.