Técnica molecular para el diagnóstico del factor V Leiden

PhD Rosana C. Gariglio
rosana.gariglio@wiener-lab.com
Centro de Investigación y Biotecnología – Wiener Laboratorios SAIC, Rosario – Argentina


El trombo embolismo venoso puede presentarse por causa de factores hereditarios, adquiridos o mezcla de ambos. Dentro de los factores genéticos, se encuentran las mutaciones en genes que codifican para los anticoagulantes naturales: antitrombina, proteínas C y S y para los factores de la coagulación: fibrinógeno, protrombina y factor V.

Dentro de la cascada del proceso de coagulación sanguínea, el factor V es esencial para la eficiente generación de trombina, enzima basal de la coagulación (responsable de la transformación de fibrinógeno en fibrina). El factor V es un cofactor procoagulante. El factor V es activo como cofactor del complejo trombinasa. El factor X activado (FXa) requiere del Calcio y del factor V para convertir la protrombina en trombina en la superficie de la membrana celular. El factor V es degradado por la proteína C activada por proteólisis secuencial de tres sitios de su cadena pesada (arginina R506, R306 y R679).

Existe una mutación llamada factor V Leiden que provoca una ganancia de funcionalidad del factor V, ya que reduce el degradado por la proteína C. Esta mutación se presenta con una frecuencia del 3 al 5% en la población caucásica y se trata de una mutación simple del nucleótido guanina (G) por adenina (A) en la posición 1691 (G1691A) del exón 10 del gen que codifica para dicha proteína, localizado en el primer cromosoma.

Además, se trata una mutación autosómica dominante produciendo casos heterocigotas y homocigotas (1 cada 5000 casos son homocigotas). Es importante poder diferenciar entre un paciente hetero de un homocigota para conocer el riesgo potencial de una trombosis venosa, considerablemente mayor en estos últimos. La literatura reporta que el riesgo de trombosis aumenta 5 veces en los individuos heterocigotas y de 30 a 140 veces en los
homocigotas, respecto a los individuos que no presentan la mutación (wild type). El resultado es la sustitución del aminoácido arginina (R) por glutamina (Q) en la posición 506 de la proteína (R506Q), generando una resistencia a la proteína C activada, llevando así a un estado de hiper coagulabilidad o trombosis por excesiva formación de trombina. Dicho de otra forma, esta sustitución elimina uno de los tres sitios de clivaje de la proteína
C activada en el factor V, lo que resulta en una inactivación más lenta del mismo,  persistiendo más tiempo en circulación y conduciendo a la generación de mayor cantidad de trombina. La prueba bioquímica para detectar la mutación de factor V de Leiden, se recomienda con fines diagnósticos a individuos que presuntamente, por su clínica y/o historia familiar, puedan padecer de Trombofilia. El screening prenatal no está indicado, debido a que las complicaciones durante el embarazo debidas a esta mutación, generalmente son maternas más que fetal.

Siendo la trombofilia más frecuente la causada por el factor V de Leiden. Su búsqueda siempre se incluye en el perfil diagnóstico de la trombofilia. Para lo mismo se realiza la prueba coagulométrica de APCR (Prueba de la resistencia a la Proteína C Activada) y en caso de dar altera da esta prueba, se solicita la evolución del FVL por ensayos genéticos.

A pesar de la gran disponibilidad de métodos comerciales para detectar mutaciones puntuales o polimorfismos simples (SNPs: single nucleotide polymorphisms) como es el caso de esta patología, los laboratorios de referencia siguen confiando en técnicas laboriosas como son las basadas en PCR (polymerase chain reaction) seguida de RFLP (digestión por enzimas de restricción) y más aún en el método Gold Standard que es la secuenciación. Los métodos moleculares son los de elección ya que no se ven afectados por embarazo, uso terapéutico de anticoagulantes, uso de anticonceptivos orales, etc. como si ocurre con las pruebas funcionales de coagulación para la detección de resistencia a la proteína C activada.

Hay varias metodologías moleculares publicadas y validadas para la detección de la mutación, entre las cuales se encuentran las que se mencionan a continuación, haciendo una breve reseña de las mismas:
1) PCR – RFLP: el amplición resultante de la PCR se digiere con enzimas de restricción y los fragmentos generados se detectan por electroforesis.

2) PCR – ASO (allele-specific oligonucleo-tide): el amplicón resultante de la PCR es hibridado en fase sólida con sondas marcadas, tanto para la secuencia normal (wild type) como para la mutada.

3) PCR – ARMS (amplification refractory mutation system): uno de los cebadores de la PCR machea o no con la mutación. Si por ejemplo el cebador machea con la secuencia normal (wild type), la ausencia de amplificación indica que está presente la mutación y viceversa.

4) FRET (fluorescence resonance energy transfer): participan sondas específicas marcadas con un fluoróforo y enzimas de corte. Al hibridizar las sondas con las secuencias específicas, las enzimas cortan la sonda liberando la molécula quencher permitiendo así un aumento de fluorescencia.

5) PCR de punto final o Real time PCR: diferencian los alelos mutados del normal mediante la hibridización con secuencias específicas.

6) Análisis con curvas de melting usando sondas FRET: la precisión de este tipo de análisis permite alta resolución para diferenciar variantes en la secuencia “templado”, gracias a cambios en las temperaturas de melting (Tm).

Un formato utilizado muy comúnmente, incluye en la PCR los cebadores específicos y un par de sondas marcadas con fluoróforos (sondas FRET). La posición de las sondas se  selecciona de modo tal que hibridizan adyacente una a otra en la secuencia templado, con una de las sondas posicionadas sobre el sitio de la mutación. Cuando ocurre la hibridización de ambas sondas y estas se encuentran en proximidad, la energía transmitida por excitación de uno de los fluoróforos (donante) es transferida al fluoróforo de la otra sonda (receptor), el cual entonces emite fluorescencia a una longitud de onda mayor (ver Figura 1).

La estabilidad de cada complejo sonda/templado tiene una Tm específica que depende de la secuencia, el largo de la misma y el contenido en G/C. Cuando está presente la mutación, la estabilidad térmica del dúplex sonda-templado se altera por la base desapareada existente (mismatch) y esto se refleja en la curva de melting obteniéndose una Tm menor a la de la secuencia wild type.

El análisis por curvas de melting tiene la habilidad de poder distinguir entre la mutación debida a factor V de Leiden y otras dos mutaciones puntuales silentes cercanas (G1689A y A1692C) que podrían generar resultados falsos positivos, pudiendo interpretarse como factor V de Leiden erróneamente. Estas variaciones puntuales en la secuencia, que no corresponden a factor V de Leiden, se pueden identificar por sus respectivas Tm, ligeramente diferentes a las Tm de la mutación de Leiden o de la secuencia wild type. Se recomienda de todas formas, que estas variantes sean confirmadas por secuenciación.

Es importante incluir controles genómicos o sintéticos en cualquiera de las metodologías mencionadas. Los mismos deben servir para validar el ensayo y a su vez permitir diferenciar la secuencia normal de la mutación hetero u homocigota. Los laboratorios que hacen este tipo de estudios deben tener un riguroso control de calidad interno y una participación satisfactoria en programas externos acreditados de aseguramiento de la calidad.