Control de la interferencia por anticuerpos en ensayos inmunológicos

Bioq. Martín Pernigotti
martin.pernigotti@wiener-lab.com
Centro de Investigación y Biotecnología – Wiener Laboratorios SAIC, Rosario – Argentina


Introducción
Es bien sabido que tanto los inmunoensayos inmunométricos (sándwich) como los competitivos, están sujetos a la interferencia de una variedad de anticuerpos endógenos, como los anticuerpos antianimales, factor reumatoideo y otros autoanticuerpos y anticuerpos heterófilos.
Pueden ser de todas las clases IgG, IgA, IgM o IgE y tienen la capacidad de unirse a anticuerpos de otras especies, así como a otras fracciones celulares o componentes del inmunoensayo.
La presencia de estos anticuerpos endógenos en el suero de los pacientes puede generar resultados falsos positivos como falsos negativos, dependiendo del tipo de interacción que generen con los anticuerpos específicos del ensayo, lo que induceuna respuesta del sistema analítico que es inconsistente con la verdadera condición clínica del paciente.
Existen numerosos informes en los que los pacientes fueron diagnosticados y tratados
incorrectamentes, ya que muchas veces puede ser difícil para los laboratorios reconocer y resolver estos resultados espurios, debido a que la aparición de la interferencia asociada a anticuerpos depende en gran medida del tipo de ensayo específico utilizado y de la prevalencia de los mismos en cada paciente (que varía ampliamente).
La Administración Federal de Drogas (FDA) y otros organismos regulatorios reconocen que los laboratorios clínicos y los fabricantes de inmunoensayos deben tener en cuenta la posibilidad de obtener resultados erróneos y tomar las precauciones adecuadas para desarrollar ensayos sólidos y recomendar procedimientos de reevaluación en caso de obtención de resultados incoherentes o inconsistentes con la patología clínica del paciente.
Los numerosos desafíos técnicos para controlar los anticuerpos interferentes y garantizar los correctos resultados analíticos se complican aún más por factores tales como, que estos anticuerpos interferentes, persisten en el paciente durante meses o años y que varían en afinidad y concentración a lo largo del tiempo, su reactividad puede diferir sustancialmente de un análisis a otro , de un método a otro y de fabricante a fabricante, causando resultados erróneos en un ensayo sin tener efecto en otro , además de evaluar cómoresolver un resultado de prueba verdadero de uno falso.
La interferencia debida a anticuerpos humanos anti-animales representa una verdadera reacción antígeno / anticuerpo.Es la reactividad específica de estos anticuerpos con los de los inmunoensayos (generalmente anticuerpos monoclonales ratón, cabra, conejo, cobayo etc.) lo que puede causar resultados falsos positivos o falsos negativos.

Esta interacción específica es distinta de la unión no específica (NSB) que se diferencia por causar altas señales de background (señales de fondo). En el caso deNSB, las proteínas, incluidos los anticuerpos y los analitos diana, pueden adherirseal soporte sólido u otros componentes del ensayo. Se pueden usar proteínas, detergentes o sustancias inertes o irrelevantes como la leche en polvo o la albúmina de suero bovino (BSA) para bloquear los sitios reactivos en los sustratos, evitando así el NSB. Por el contrario, los anticuerpos
interferentes deben bloquearse utilizando anticuerpos específicos y/o anticuerpos normales de la misma especieque el ensayo.

Tipos de anticuerpos interferentes
• Anticuerpos humanos anti-animales (HAAA)
Los anticuerpos humanos anti-animales resultan de una verdadera respuesta inmune que ocurre después de la exposición a proteínas animales. El más ampliamente reconocido de este grupo y probablemente el que más interfiere es el anticuerpo humano anti-ratón (HAMA), pero no es único ya que los anticuerpos humanos se producen contra una variedad de especies, incluyendo conejos, perros, cabras, ovejas, vacas o ratas.

Los HAMA pueden causar interferencia en los ensayos tipo sándwich compuestos por monoclonales de ratón, y otros HAAA pueden interferir con los ensayos diseñados con anticuerpos policlonales de diferentes.Hay muchos factores que influyen en el desarrollo de estos HAAA o HAMA:

– Tipo de exposición a la especie animal: manejo de alimentos, mascotas, cuidado de animales domésticos o de laboratorio.
-Terapia con anticuerpos monoclonales: factores que cobran cada vez mayor importancia a medida que las aplicaciones de estas modalidades terapéuticas (principalmente contra algunos tipos de canceres) se vuelven más frecuentes.

Estos anticuerpos pueden ser de alta afinidad y reactivos a una variedad de dominios de inmunoglobulina y cualquier clase o subclase de anticuerpos y dado que los anticuerpos están altamente conservados en todas las especies, un anticuerpo contra las inmunoglobulinas de una especie puede reaccionar de forma cruzada con las inmunoglobulinas de otra especie.

Factor reumatoide (RF)
• El RF es típicamente un anticuerpo de clase IgM que reconoce la región Fc de las
IgG. El RF puede unirse no solo a la IgG humana sino también a las inmunoglobulinas
de otras especies. Se encuentra en muchos pacientes con artritis reumatoide, algunas poblaciones normales y otros pacientes con una variedad de enfermedades autoinmunes.
• Anticuerpos heterófilos: Esta descripción puede referirse ampliamente a anticuerpos
humanos con la capacidad de unirse a anticuerpos animales, antígenos o algunos autoantígenos, pero se usa con más precisión para describir anticuerpos polirreactivos contra antígenos mal definidos o desconocidos. Se encuentran en aproximadamente el 40% de la población.
Por lo general, son de baja afinidad y débilmente reactivos, pero aún pueden reaccionar con los anticuerpos y competir efectivamente por los sitios de unión con el analito.

• Cómo los anticuerpos interferentes impactan los resultados:

Figura 1
A) Un ensayo normal sin interferencia de anticuerpos.
B) Un resultado falso positivo con el anticuerpo interferente (negro) formando un puente entre el anticuerpo de detección (rojo) y el de captura ocupando el lugar del analito/antígeno.

C) Un resultado falso negativo donde el ac. interferente se une al ac. detector y/o captura, impidiendo que el analito se una correctamente a éstos.
Figura 2
A) Un ensayo normal sin interferencia de anticuerpos.
B) Un resultado falso negativo con el anticuerpo interferente impidiendo, que el
analito/antígeno. marcado y sin marcar, compita por el anticuerpo de captura.

Cómo los agentes bloqueantes previenen los falsos resultados

Es importante considerar cómo controlar los anticuerpos interferentes durante la fase de desarrollo de cualquier inmunoensayo. Si bien no existe un enfoque universal para controlar las interferencias para todos los sistemas de ensayo, es importante tener en cuenta el desarrollo de un sistema de bloqueo que considere todas las características del ensayo específico en desarrollo, incluidos los anticuerpos utilizados, el analito y la población de pacientes a las que va direccionado el ensayo.

Las estrategias de bloqueo se basan típicamente en la adición de sueros normales
no inmunes específicos de especies, IgG policlonal, anticuerpos monoclonales de
ratón no inmunes, inmunoglobulinas antihumanas o fragmentos de IgG.

Para algunos ensayos, el bloqueo pasivo es efectivo y puede lograrse mediante la simple adición de suero normal o inmunoglobulinas o subunidades normales purificadas de la misma especie que el ac. detector y los de captura, lo cual neutraliza a los anticuerpos interferentes y reduce la probabilidad de que se unan al ac. detector o de captura. Un bloqueo pasivo puede no ser suficiente en muchos casos debido a factores como la presencia de altas concentraciones de anticuerpos interferentes de alta afinidad que pueden sobrepasar al sistema de bloqueo y requieren un enfoque más específico. En este caso, puede ser necesaria una estrategia de bloqueo activa utilizando anticuerpos dirigidos
que se unan y neutralicen componentes específicos de posibles interferencias.

Las formulaciones de bloqueo pueden necesitar incorporar un enfoque de varios niveles e incluir anticuerpos purificados de la misma subclase, subunidades, polímeros, anticuerpos específicos o un cóctel de varios componentes que pueden neutralizar factores como HAMA y RF al mismo tiempo. En algunos ensayos, las bajas  concentraciones de agentes bloqueantes pueden ser eficaces, mientras que otros ensayos requieren concentraciones mucho más altas y/o un enfoque escalonado para ser efectivos.

La formulación debe considerarse con respecto al ensayo específico y desarrollarse con muestras de pacientes positivas y negativas y aquellas que se sabe que contienencomponentes interferentes. Si bien los fabricantes de reactivos de bloqueo pueden intentar proporcionar datosrelevantes sobre la eficacia del bloqueador, la evaluación y la optimización del bloqueador deben realizarse en el inmunoensayo en el que se utilizará. Un ensayo en sándwich con dos monoclonales de ratón puede tener requisitos muy diferentes que un ensayo con anticuerpos de dos especies diferentes. Las demandas de un ensayo de un solo paso también pueden ser más sensibles a los anticuerpos interferentes
que un ensayo de dos pasos donde pueden diluirse o eliminarse mediante lavado.
Todos estos factores deben considerarse para desarrollar formulaciones efectivas para controlar la interferencia asociada a anticuerpos y lograr un sistema optimizado para un ensayo específico.

En general: Las estrategias para controlar HAAA típicamente incluyen sueros o clases de anticuerpos purificados de la misma especie y clase que los contenidos en el inmunoensayo. Los reactivos de bloqueo proporcionan anticuerpos que ocupan sitios de unión en el HAAA, evitando así la interferencia.

Un enfoque eficaz para controlar la influencia de RF es incluir un anticuerpo anti-RF como componente en el sistema de bloqueo. La interferencia por ac. heterófilos se puede minimizar con la adición de sueros normales o anticuerpos purificados de la misma especie utilizada en el ensayo. Estos anticuerpos normales saturan los sitios de unión de los anticuerpos heterófilos y evitan que ocurra interferencia.

Conclusión
La interferencia de anticuerpos interferentes siempre será una amenaza en los inmunoensayos, pero la incidencia y el daño pueden reducirse mediante la vigilancia
y los enfoques colaborativos de los médicos, laboratorios y fabricantes de inmunoensayos.

Los médicos deben considerar la interferencia y comunicarse con los laboratorios de análisis cuando los resultados son discordantes con la imagen clínica. Los laboratorios
deben elegir ensayos que estén bien protegidos y, si es posible, reemplazar los métodos que presentan este tipo de interferencias.
Los laboratorios deben estar abiertos a preguntas de los médicos con respecto a la validez de los resultados del inmunoensayo, y estar seguros y capacitados para dar respuesta usando algún método diferente para discernir entre los resultados obtenidos.