Métodos diagnósticos para Covid-19

Métodos diagnósticos para COVID-19
Dra. Claudia Elena / Bioq. Ivan Ruiz
claudia.elena@wiener-lab.com / ivan.ruiz@wiener-lab.com
Product Team – Wiener Laboratorios SAIC, Rosario – Argentina


La disponibilidad de ensayos de diagnósticos precisos y de testeos masivos son factores críticos para mitigar el brote de infecciones respiratorias. La detección temprana permite políticas de salud pública para prevenir y controlar la diseminación del agente infeccioso. Esto ha quedado expuesto con la aparición de un nuevo coronavirus conocido como SARS-CoV-2, que fuera primeramente identificado como la causa del brote de neumonía en Wuhan, China, en diciembre de 2019, y que rápidamente se propagó al resto del mundo.

La obtención de la primera secuencia del genoma del SARS-CoV-2 fue determinante para el desarrollo de ensayos moleculares de diagnóstico que actualmente permiten detectar los casos de infección por SARS-CoV-2.

Diagnóstico de laboratorio para pacientes comprendidos en la definición de caso sospechoso
La decisión de realizar el test para COVID-19 debe estar basado en factores clínicos y epidemiológicos ligados a la probabilidad de infección, según definición de caso sospechoso. Los tests de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR) sobre contactos asintomáticos o con sintomatología leve se consideran en casos de individuos que hayan tenido contacto cercano con casos confirmados de COVID-19. La definición de caso sospechoso es regularmente revisada y actualizada a medida que se va obteniendo mayor información sobre la infección por SARS CoV-2.

El diagnóstico de la infección por SARS-CoV-2, se basa en la detección de genoma viral a través de técnicas de biología molecular como es la RT-qPCR. Dentro de las muestras de elección para procesar a través de esta metodología se encuentran:

• muestras de tracto respiratorio superior: hisopado nasofaríngeo y orofaríngeo en pacientes ambulatorios;
• y/o muestras de tracto respiratorio inferior en pacientes con enfermedad respiratoria severa: esputo, aspirado (endo)traqueal o lavado bronqueoalveolar.

En adición a estos, otras muestras pueden ser consideradas para diagnóstico de COVID-19 dado que el virus también ha sido detectado en sangre y en heces, del mismo modo que previamente se ha hecho con los coronavirus responsables del SARS y MERS. Sin embargo, la duración y la frecuencia de la excreción del virus en heces, y eventualmente en orina, aún no se conoce con exactitud. En caso de pacientes fallecidos, se considera la autopsia a partir de tejido de pulmón.

Técnicas de diagnóstico molecular para COVID-19
La confirmación de casos está basada en la detección de secuencias génicas RT-qPCR del virus, para lo cual es necesario un paso previo de transcripción reversa de su genoma de RNA, y luego la amplificación de targets específicos por técnicas de RT-qPCR. La extracción del RNA debe ser realizada en cabinas de bioseguridad BSL-2 o equivalentes.

En general, los distintos métodos moleculares se basan en la amplificación de regiones conservadas del virus: el gen RdRP (RNA-dependent RNA polymerase gene) en el marco abierto de lectura de la región ORF1ab; el gen E (gen que codifica para la proteína de la envoltura viral), y el gen N (gen que codifica para la proteína de la nucleocápside). La mayor parte de los ensayos comercialmente disponibles están diseñados para la amplificación de dos genes targets, algunos de ellos utilizan un par de cebadores para la detección genérica de los Betacoronavirus, y un segundo par de primers específicos para SARS-CoV-2 (grafico 1), mientras que otros están basados en la detección de 2 (o más) genes específicos para SARS-CoV-2. Según las últimas recomendaciones de la OMS, en áreas donde el virus se encuentra ampliamente difundido, se está aplicando un algoritmo simplificado, y se considera suficiente realizar el screening por RT-qPCR de un único target.

Dada la variabilidad en las cargas virales, un resultado negativo no excluye la positividad de infección.

Estos resultados negativos pueden deberse a:
• una inapropiada toma de muestra, o baja carga viral en el área de donde se tomó la muestra,
• tiempo de recolección de la muestra inadecuado: demasiado tarde o demasiado temprano en la infección,
• manejo y/o envio inadecuado de la muestra,
• motivos técnicos del test, como inhibición de la PCR.

De obtenerse un resultado negativo a partir de muestras de un paciente con alta sospecha clínica de infección por SARS-CoV-2, particularmente cuando solo se ha tomado una muestra de tracto respiratorio superior, de ser posible se aconseja tomar adicionalmente otro tipo de muestras, incluyendo muestras del tracto respiratorio inferior para realizar pruebas adicionales. Es importante señalar que toda prueba de RT-qPCR debe incluir tanto controles externos (positivos y negativos), como controles internos de amplificación.

Metodologías serológicas
Se han desarrollado una amplia gama de inmunoensayos serológicos (IEs) que complementan los ensayos moleculares para el diagnóstico de COVID-19. Los IEs más importantes están representados por pruebas de quimioluminiscencia (CLIA), técnicas de ELISAs y tests rápidos por inmunocromatografia de flujo lateral, que detectan anticuerpos IgM e IgG producidos por el sistema inmune en respuesta a la infección por SARS-CoV-2.
Según las últimas publicaciones, la FDA recomienda utilizar las pruebas serológicas para identificar aquellos individuos que han estado expuestos al virus del SARS-CoV-2 o que se han recuperado de la infección. Por el lado de la OMS, hasta el momento, recomienda el uso de los tests rápidos solo con fines epidemiológicos.

Hay que tener en cuenta que, en los primeros días de la infección, los anticuerpos pueden no estar presentes en niveles detectables. Esto limita la efectividad de las pruebas serológicas como diagnóstico, siendo las técnicas de RT-qPCR la metodología de elección por su mayor sensibilidad diagnóstica. Diversos estudios coinciden en que los anticuerpos IgM frente a SARS-CoV-2 comienzan a aparecer aproximadamente entre los días 5-7 desde el inicio de los síntomas, y recién a partir del día 14 aparecerían los anticuerpos de tipo IgG (Tabla 1). Actualmente, al utilizar técnicas serológicas como metodología de screening, en caso de resultado positivo ya sea para IgM y/o IgG anti-SARS-CoV-2, el diagnostico confirmatorio de infección se realiza por técnicas de RT-qPCR.

En este sentido, los test serológicos pueden ser un buen complemento de las pruebas moleculares, ayudando a determinar estadios de la infección y detectar posibles falsos negativos en técnicas de RT-qPCR. Por el momento, está en discusión si el desarrollo de anticuerpos puede neutralizar una nueva infección; aún así, existen varios protocolos de estudios para la evaluación de la utilización del plasma de pacientes convalecientes como posible tratamiento.

Referencias
* Informe SARs-CoV-2. Sociedad Argentina de Virología, División de la Asociación Argentina de Microbiología 26 de marzo de 2020.
* FDA. https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/emergency-use-authorizations#covid19ivd
* WHO.https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/sb-2020-1-poc-immunodiagnostics-2020-04-08-e.pdf?sfvrsn=4c26ac39_2