Pruebas genéticas. Secuenciación y aplicaciones clínicas

Pruebas genéticas. Secuenciación y aplicaciones clínicas
Dra. Luisina Cappellino
luisina.cappellino@wiener-lab.com
Centro de Investigación y Biotecnología – Wiener Laboratorios SAIC, Rosario – Argentina


Una copia del genoma humano contiene más de 3.000 millones de pares de bases (pb). Sin embargo, desde el siglo XIX, descubrimientos y desarrollos han permitido conocerlo en profundidad. En 1865, Gregor Mendel introdujo las leyes fundamentales de la herencia. En 1953, James Watson y Francis Crick describieron la estructura de doble hebra complementaria helicoidal y antiparalela del ADN. Trece años después, fue descubierto el código genético. El método de secuenciación manual de Frederick Sanger impulsó el desarrollo de tecnologías como FISH, hibridación en microarreglos y PCR (desarrollada en 1993).

La automatización de la secuenciación de Sanger (primera generación) permitió lanzar el Proyecto Genoma Humano para revelar su secuencia completa. Se alcanzó el objetivo en el año 2000, con la obtención del primer borrador de dicha secuencia. Desde entonces, comenzó a vislumbrarse la potencialidad de este logro para el desarrollo de una medicina a la medida de cada paciente. La secuenciación del genoma humano y el desarrollo de las tecnologías de secuenciación de segunda generación (Next Generation Sequencing) y de las de tercera generación, han permitido incrementar la capacidad de procesamiento y reducir el costo, con lo que aumentó la demanda de pruebas genéticas de diverso tipo.

Sistemas utilizados para la secuenciación de ácidos nucleicos. (Figura 1)
Primera generación: esta técnica se basa en fragmentar el ADN, amplificarlo mediante clonado en bacterias y la ADN polimerasa al sintetizar la hebra complementaria al ADN molde a secuenciar, incorpore nucleótidos modificados (dideoxinucleótidos) en diferentes posiciones de la hebra sintetizada, a partir de los cuales ya no es posible que continúe la elongación. Así, se generan diferentes fragmentos de menor tamaño que el molde, todos iniciados a partir del cebador.

En el método original se realizaban cuatro reacciones de síntesis, cada una con un nucleótido distinto (A, T, G, C), y los fragmentos obtenidos se analizaban en geles de agarosa, combinando los resultados de los cuatro experimentos. Posteriormente se modificó, siendo hoy el estándar de calidad de secuenciación: se comenzaron a emplear nucleótidos terminadores marcados con moléculas fluorescentes de cuatro colores distintos, para poder realizar un único experimento. Además, la secuencia se lee por electroforesis capilar. Esta técnica permite actualmente obtener lecturas de 600-900 pb con una tasa de error de 0,01-0,1%, pero sus costos son elevados.

Secuenciación de segunda generación (NGS): estos equipos son comercializados desde 2005 y cada plataforma se basa en diferentes principios químicos, pero con algunas características comunes:
• El ADN se fragmenta al azar y se unen adaptadores en ambos extremos de cada fragmento.
• La amplificación de la biblioteca de fragmentos genómicos se produce mediante el anclaje de los mismos, a través de los adaptadores, a una superficie sólida (microesferas o placa de secuenciación), realizando PCR de manera paralela.
• La secuenciación y detección de las bases ocurren al mismo tiempo en todas las moléculas de ADN (masivo y paralelo).
• Permiten leer ambos extremos de un mismo fragmento.

Secuenciación de tercera generación: esta tecnología es la más reciente y evita la PCR antes de la secuenciación, lo que reduce el tiempo de análisis y los errores derivados de esta técnica. La detección de nucleótidos se realiza en tiempo real. Hasta ahora, existen dos empresas que comercializan equipos con principios diferentes:
• La medición de fluorescencia para identificar bases de una única molécula en tiempo real, añadiendo los cuatro nucleótidos simultáneamente. Se leen hasta 30000 pb.
• La utilización de un nanoporo biológico, similar a un canal iónico de membrana plasmática, a través del cual puede pasar una única molécula de ADN. Su tránsito modifica el voltaje del canal, cada nucleótido tiene una estructura diferente y puede ser reconocido por el efecto que induce sobre la corriente iónica. En general, las lecturas son de más de 10000 pb.

Pruebas genéticas
Las pruebas genéticas son un tipo de pruebas médicas que identifican cambios en los cromosomas, genes o proteínas. Muchas de ellas se basan en la secuenciación de regiones del genoma o del genoma completo de un individuo, en busca de variaciones con respecto a una secuencia consenso (es decir, aquella que está más representada en la población). Pueden ocurrir variaciones de nucleótido único, inserción o deleción de un pequeño número de bases (indels), o rearreglos estructurales o cambios en el número de copias (pérdidas, duplicaciones o translocaciones de grandes segmentos).
Este tipo de pruebas es, en general, realizado como parte de una consulta genética y sus resultados pueden confirmar o descartar una condición genética sospechada o ayudar a determinar las posibilidades de desarrollar o transmitir un trastorno genético.

Tipos de pruebas genéticas
En general, el tipo de prueba genética más conveniente para un individuo se define según su historia médica y familiar.

De acuerdo con la cantidad de genes estudiados, estas pruebas se pueden clasificar en:

Tests de gen único: en este caso, se buscan cambios en un único gen cuando existe sospecha médica de una condición específica (monogénica) en base a los síntomas o a la historia familiar, por ejemplo, la distrofia muscular de Duchenne.

Tests de paneles: éstos buscan cambios en muchos genes de un grupo, según las sospechas médicas, por ejemplo, los paneles de epilepsia.

Tests genéticos de gran escala, que pueden ser de dos tipos:
• Secuenciación de exoma: la mayoría de las mutaciones conocidas que causan enfermedades ocurren en los exones (región codificante de proteínas). Así, se buscan cambios en todos los genes (exoma completo) o sólo en aquellos relacionados con condiciones médicas (exoma clínico).
• Secuenciación de genoma completo: es el tipo de test genético más grande ya que estudia todo el ADN de una persona, no sólo sus genes. Esto se debe a que variaciones del ADN por fuera de los exones pueden afectar la actividad genética y la producción proteica. Esta técnica, además de mutaciones puntuales, detecta indels, variaciones en el número de copias y translocaciones.

Estos test de gran escala son solicitados para personas con historias médicas complejas. Por otro lado, la secuenciación de genes individuales o de paneles de genes reduce el tiempo y costo de secuenciación y análisis, en escenarios clínicos conocidos. Asimismo, existen pruebas que analizan otros cambios, como modificaciones en los cromosomas o en la expresión de genes.

Por otro lado, es posible diferenciarlas en función de la información que estas pruebas pueden brindar:
Pruebas diagnósticas: que permiten identificar de manera precisa una enfermedad, ayudar a definir un tratamiento, evitar intervenciones inapropiadas y anticipar síntomas.

Pruebas predictivas y pre-sintomáticas: tienen como finalidad encontrar variaciones genéticas que incrementarían la probabilidad de desarrollar enfermedades, lo que permitiría realizar modificaciones en el cuidado de la salud. Estos tests serían particularmente útiles para personas que tienen familiares con un desorden genético, pero sin tener características de dicho desorden ellos mismos (por ejemplo, algunos tipos de cáncer).

Pruebas de portación: se ofrecen a personas con historia familiar de una enfermedad hereditaria o a grupos étnicos con riesgos de enfermedad hereditaria específica. Se investiga si portan una copia de una mutación que, cuando está presente en dos copias, causa una enfermedad (condición recesiva). Si ambos padres son examinados, pueden tener información sobre el riesgo de tener un hijo portador o que desarrolle la enfermedad, generándose así la posibilidad de optar por el diagnóstico preimplatacional. Aunque el análisis suele ser dirigido a ciertas condiciones, recientemente se han vuelto disponibles análisis más amplios que buscan mutaciones en docenas de genes.

Pruebas de preimplantación: es una técnica que puede reducir el riesgo de tener un niño con un desorden genético o cromosómico, analizando los embriones creados mediante técnicas de reproducción asistida como la fertilización in vitro.

Pruebas prenatales: se realizan durante el embarazo para ayudar a determinar si el feto tiene ciertos desórdenes, detectando cambios en sus genes o cromosomas.

Pruebas a recién nacidos: se emplean para evaluar si bebés de uno o dos días pueden tener ciertas enfermedades que causen problemas en su desarrollo, las cuales podrían ser tratadas tempranamente.

Pruebas farmacogenómicas: brindan información sobre cómo ciertas medicinas son procesadas por cada organismo en función del perfil genético, permitiendo así elegir aquellas que funcionen mejor en ese contexto.

Perfil genético de tumores: el cáncer posee una combinación única de cambios genéticos en cada persona, y conocerla puede ayudar a determinar un tratamiento. Esto sería más beneficioso en casos de cánceres que puedan ser tratados con terapias dirigidas, para pacientes con cáncer avanzado que no responden a tratamientos estándar o para los cuales éstos no existan. Sin embargo, en ocasiones, no es posible identificar la alteración genética, o ésta no puede ser tratada o existen características biológicas que influyen sobre la respuesta a una terapia. Además, la heterogeneidad celular en un tumor puede incidir en los resultados obtenidos.

Las pruebas clínicas mencionadas difieren de las pruebas genéticas directas al consumidor, las cuales pueden brindar información, generalmente a personas sanas, sobre rasgos médicos y no-médicos: ascendencia, respuesta a medicamentos o alimentos, o riesgo de desarrollar ciertas condiciones. Habitualmente, la persona toma una muestra en su hogar, la envía a analizar y obtiene su perfil genético. Así, podría modificar su modo de vida o cuidado médico, pero se debe tener en cuenta que las pruebas no son concluyentes, no debiendo ser la única referencia para la toma de decisiones médicas.

El avance de las tecnologías genéticas hace necesario abordar las cuestiones legales y éticas relativas a su implementación. Asimismo, el asesoramiento genético es central en el proceso de testeo e involucra la interpretación de la historia familiar y médica, así como la discusión con los pacientes sobre las ventajas, desventajas y los aspectos sociales y emocionales.

El impacto de las pruebas genéticas, de las nuevas tecnologías de secuenciación y de la bioinformática parece aún difícil de predecir de manera certera. Sin embargo, su aplicación supondrá un cambio de paradigma en las áreas de diagnóstico y medicina, orientado hacia una medicina de precisión adaptada a las características moleculares de cada paciente.

 

Bibliografía
* Krier,JB y col. Genomic sequencing in clinical practice: applications, challenges, and opportunities (2016).
* Martí,M. Genoma y salud: cómo la capacidad de leer nuestro ADN está revolucionando la medicina (2017).
* NIH. US National Library of Medicine. Genetic Testing (https://ghr.nlm.nih.gov/). Genetics home reference (2020).