¿Qué necesitamos conocer acerca de los métodos serológicos para COVID-19?

¿Qué necesitamos conocer acerca de los métodos serológicos para COVID-19?
Dra. Claudia Elena / Bioq. Ayrton Dovetta
claudia.elena@wiener-lab.com / ayrton.dovetta@wiener-lab.com
Marketing Corporativo – Wiener Laboratorios SAIC, Rosario – Argentina

 


Las pruebas de anticuerpos para SARS-CoV-2 pueden desempeñar un papel importante en la comprensión epidemiológica del virus. Estas pruebas permiten estudiar si la persona estuvo infectada, o en contacto con alguno de los componentes del virus, mediante la medición de la respuesta inmunitaria humoral. A diferencia de los métodos directos, como los test de diagnóstico molecular y los test de detección de antígenos para SARS-CoV-2, los test de anticuerpos no son de utilidad para detectar la infección aguda, y por lo tanto, no deben ser utilizados para el diagnóstico. Aun así, la utilidad de los test de anticuerpos está relacionada al monitoreo de la pandemia y la toma de decisiones, pudiéndo ser usados en estudios de seroprevalencia, titulación del plasma de donantes para tratamiento con plasma convaleciente, estudios de la respuesta humoral en la población vacunada, y en casos de alta sospecha clínica de infección con resultados de RT-PCR negativos.
Antígenos utilizados en los test de anticuerpos
En lo que respecta a la composición proteica del virus SARS-CoV-2, tenemos 4 proteínas estructurales conocidas como: S (Spike o espícula), E (Envoltura), M (Membrana) y N (Nucleocápside). La proteína N forma la nucleocápside que rodea y contiene el genoma del RNA viral, mientras que las proteínas S, E y M conforman la envoltura viral (Figura 1).

Los dos targets antigénicos de SARS-CoV-2 más utilizados en los métodos serológicos para la detección de anticuerpos son la glicoproteína S de la espícula del virus y la fosfoproteína N de la nucleocápside. Mientras que la proteína S está presente en la superficie del virus y es esencial para la entrada a la célula que infecta, la proteína N es la que se expresa de forma más abundante e interacciona con el RNA viral. Múltiples formas de la proteína S, ya sea completa (subunidades S1 + S2) o parcial a través de la subunidad S1 o su dominio RBD (Receptor binding Domain) son utilizadas como antígenos. La proteína N es más conservada entre los coronavirus que la proteína S, mientras que dentro de esta última, el dominio RBD (perteneciente a la subunidad S1) es la región menos variable. Según cual o cuales de estas proteínas targets estén utilizadas en el diseño del ensayo, estas van a determinar la especificidad y la posible reactividad cruzada del mismo.
Tipos de pruebas de detección de anticuerpos
En general estas pruebas pueden ser realizadas en laboratorios sin requerimiento de altos niveles de bioseguridad, ya que las muestras utilizadas poseen baja carga viral o no detectable. Algunas pruebas pueden diferenciar IgG, IgM e IgA, mientras que otras detectan Inmunoglobulinas totales.
Se puede clasificar estas pruebas en 2 amplias categorías:
• Point of Care (POC): generalmente son inmunocromatografías de flujo lateral, conocidas como “test rápidos”, pueden presentarse en tiras o casetes, los resultados pueden obtenerse en 15 minutos, no se requiere equipamiento específico y las muestras más utilizadas son suero, plasma, sangre entera y/o sangre capilar. La posibilidad de utilizar sangre capilar genera que este tipo de test puedan ser utilizados en estudios masivos y zonas con escasa infraestructura.
• Laboratorio central: en esta categoría se agrupan ensayos con métodos de ELISA y de quimioluminiscencia, los cuales requieren mayor infraestructura y/o equipamiento. La mayoría de estas técnicas no utilizan sangre entera, por lo que requieren un paso de centrifugación para obtener el suero o plasma del paciente.
En muchos casos, aún no está clara la cinética de anticuerpos. Diversos estudios señalan que la aparición de anticuerpos específicos a-SARS-CoV-2 de tipo IgM, IgA e IgG se da aproximadamente entre los días 5 a 14 del inicio de los síntomas. Sin embargo, existe evidencia que cambian el principio ya asumido de la seroconversión temprana para anticuerpos IgM seguida de una respuesta más tardía de anticuerpos de tipo IgG. En un trabajo reciente publicado se describe 3 tipos de respuestas inmunes distintas: seroconversión temprana de IgM seguida de IgG, seroconversión sincrónica de anticuerpos IgM/IgG e incluso casos de seroconversión para anticuerpos IgG seguida de la aparición de anticuerpos IgM (1).
Por otro lado, con la introducción de las distintas alternativas de vacunación se han sumado técnicas cuantitativas que permiten dosar los niveles de anticuerpos neutralizantes, específicamente, cuantificando los niveles de anticuerpos dirigidos contra la proteína S del virus. Otro formato de reciente aparición son los ensayos de actividad que permiten medir los niveles de los anticuerpos neutralizantes (NAbs) midiendo el bloqueo de la interacción entre la proteína Spike y su receptor ACE2. Este tipo de tests en general se basan en el principio de inhibición competitiva. En presencia de anticuerpos neutralizantes, la interacción entre el dominio RBD y ACE2 es obstaculizada/interrumpida, lo que provoca ausencia de señal en el revelado. El método de referencia para la medición de actividad de anticuerpos neutralizantes es el ensayo de neutralización por reducción de placas (PNRT) el cual resulta bastante complejo y requiere niveles de bioseguridad de tipo 3, por lo que la simplicidad de este tipo de ensayo de actividad (generalmente en formato ELISA) lo hace más conveniente y adaptable al uso del laboratorio clínico.

Performance de tests serológicos para anticuerpos a-SARS-CoV-2
A la hora de conocer la performance para comparar y decidir la prueba de laboratorio a utilizar, uno de los criterios más influyentes son la sensibilidad y especificidad  de la prueba en cuestión. La sensibilidad de un test corresponde a la proporción de verdaderos positivos correctamente identificados por el test. Para realizar esta evaluación, se utiliza un conjunto definido de muestras positivas [(Verdaderos Positivos) / (Verdaderos Positivos + falsos negativos)]. Por el otro lado, la especificidad corresponde a la proporción de verdaderos negativos correctamente identificados. Para evaluar la especificidad, se utiliza un conjunto de muestras negativas [(Verdaderos Negativos) / (Verdaderos Negativos + Falsos Positivos)]. Tanto la sensibilidad, como la especificidad son intrínsecos al test, es decir no dependen de la población estudiada.
Otros parámetros de utilidad son el Valor Predictivo Positivo (VPP) y el Valor Predictivo Negativo (VPN). El VPP es la probabilidad de que las personas con resultados positivos posean realmente anticuerpos [(Verdaderos Positivos) / (Verdaderos Positivos + Falsos Positivos)], mientras que el VPN es la probabilidad de que las personas con resultados negativos no posean anticuerpos [(Verdaderos Negativos / Verdaderos Negativos + Falsos Negativos)]. .
Los cuadros 1; 2; 3 y 4, ejemplifican situaciones teóricas diferentes, donde se utilizan 2 test con diferente especificidad (95% y 99%) en 2 poblaciones diferentes, con 5% y 10% de prevalencia respectivamente. El objetivo de estos cuadros es demostrar como el VPP aumenta considerablemente al aumentar la prevalencia de la población y/o la especificidad del test utilizado.
Las columnas “Posee anticuerpos” y “No posee anticuerpos” representan el estado real, mientras que las filas indican el resultado obtenido con el test evaluado.
Como puede observarse, del análisis de los ejemplos anteriores surge que ambos parámetros, VPP y VPN, además de depender de la sensibilidad y especificidad del test, son afectados considerablemente por la prevalencia de la población estudiada, ya que definirá la proporción de verdaderos positivos y verdaderos negativos analizada.
Para mitigar el efecto de las bajas prevalencias sobre el VPP pueden aplicarse diferentes estrategias, como estudiar a individuos con altas probabilidades de tener anticuerpos positivos (aumentando indirectamente la “prevalencia” de la población estudiada) o confirmar los resultados positivos con un segundo test con un diseño diferente.

Consideraciones prácticas a la hora de utilizar e interpretar los resultados de las pruebas serológicas para COVID-19
• Los test de anticuerpos para SARS-CoV-2 no deben ser utilizados para realizar diagnóstico. No reemplazan a los métodos de detección directa.
• Aún no es clara la cinética de los anticuerpos, por lo tanto, es recomendable utilizar test que detecten tanto IgG como IgM, o bien anticuerpos totales.
• Según el ensayo utilizado, un resultado positivo para anticuerpos, indicaría que el individuo estuvo en contacto con el virus SARS-CoV-2 o con alguno de sus componentes (en caso de respuesta a vacunas). Esto no significa que esté cursando la infección al momento de la toma de muestra.
• A la hora de utilizar un test de anticuerpos, verificar que antígenos utiliza para la detección de los anticuerpos, de manera de revisar si detecta individuos que tuvieron en contacto con el virus y si puede ser utilizado para el estudio de la respuesta inmune frente a vacunas en personas que no han estado infectadas.
• Dentro de las posibilidades, seleccionar test de anticuerpos con alta especificidad, a fin de minimizar la tasa de falsos positivos.
• Se recomienda a las personas con anticuerpos positivos continuar cumpliendo con las medidas de prevención. Aún no está establecido el grado de protección generado por los anticuerpos.

Bibliografía
1- Long, QX, Liu, BZ, Deng, HJ. et al. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients with COVID-19. Nat Med 26, 845–848 (2020). https://doi.org/10.1038/s41591-020-0897-1
2- CDC. Interim Guidelines for COVID-19 Antibody Testing. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/resources/antibody-tests-guidelines.html