La tecnología RT-PCR como herramienta para el diagnóstico y seguimiento de la infección por virus SARS-CoV-2

La tecnología RT-PCR como herramienta para el diagnóstico y seguimiento de la infección por virus SARS-CoV-2
PhD, Rosana Gariglio
rosana.gariglio@wiener-lab.com
Centro de Investigación y Biotecnología – Wiener Laboratorios SAIC, Rosario – Argentina


Ante la aparición y rápida diseminación del virus SARS-CoV-2 a nivel mundial, el principal desafío ha sido contar de forma urgente con métodos de diagnóstico confiables para detectar el virus, ante una demanda creciente y constante. La identificación y el aislamiento rápidos de los individuos infectados son cruciales. Dado que los síntomas y los hallazgos radiológicos de la enfermedad que provoca este virus conocida como COVID-19 son inespecíficos, la infección por el SARS-CoV-2 debe confirmarse lo antes posible.

En las infecciones respiratorias agudas en general, la RT-PCR es utilizada rutinariamente para detectar los microorganismos con genomas a ARN (ácido ribonucleico) responsables de las mismas, a partir de secreciones respiratorias. Esta robusta tecnología ampliamente desplegada en diagnóstico virológico, ha servido ante esta emergencia en la salud pública mundial, para establecer las nuevas pruebas diagnósticas.

En general, el diagnóstico de laboratorio de SARS-CoV-2 (infección aguda) se basa en pruebas de detección directa del genoma viral, amplificando específicamente regiones genómicas altamente conservadas del virus, a partir de muestras respiratorias. Dentro de los métodos moleculares de detección del virus, la RT-PCR es considerada la prueba gold-standard para el diagnóstico de personas sintomáticas con sospecha de COVID-19.

La mayoría de los tests comerciales disponibles basados en RT-PCR, amplifican simultáneamente más de una región genómica del virus, lo que aporta una mejor sensibilidad y confiabilidad en la detección. Estos tests utilizan secuencias nucleotídicas de regiones altamente conservadas del genoma viral, relacionadas a las proteínas de la nucleocápside (gen N), de la ARN polimerasa dependiente de ARN (gen RdRp) y/o de la cubierta (gen E)(Figura 1).

En general, las mutaciones o variaciones en el genoma viral que pueden ocurrir en la región de unión de los cebadores diseñados para la RT-PCR, pueden influir en la performance de los tests. Por esta razón, los mismos deben monitorearse continuamente para comprobar su compatibilidad con las cepas de virus circulantes. Este seguimiento es muy importante en el caso del SARS CoV-2 ya que se han descripto varias mutaciones.

Debido a su elevada sensibilidad, la RT-PCR puede detectar secuencias del ARN del SARS-CoV-2 desde la fase asintomática de la incubación hasta varias semanas después de la resolución del cuadro clínico. Sin embargo, se han descrito porcentajes variables de falsos negativos debido a factores asociados con la obtención y procesamiento de la muestra y con la dinámica de la carga viral (CV).
Hay publicaciones que describen mayor porcentaje de falsos negativos en los primeros 5 días después de la infección (hasta de un 67%) y menor porcentaje en el día 8 (21%), por lo que sería aconsejable que las pruebas de RT-PCR se realicen de 1 a 3 días después de la aparición de los síntomas para así minimizar los riesgos de un mal diagnóstico y evitar la transmisibilidad de la infección.

Si bien hay disponibles excelentes técnicas para el diagnóstico de pacientes sintomáticos con COVID-19 en laboratorios bien equipados, aún quedan brechas críticas para el screening de personas asintomáticas que se encuentran en fase de incubación de la infección, así como en la determinación precisa de la diseminación de virus vivos durante la convalecencia, para definir correctamente el fin del aislamiento.

Por otra parte, desde el comienzo de la pandemia se viene realizando un gran número de ensayos clínicos en tiempos de ejecución y evaluación muy acotados. Debido a esto, surge la necesidad de contar con métodos estandarizados y validados clínicamente, para el monitoreo de la infección, que permitan evaluar las diferentes alternativas terapéuticas que van apareciendo. Estos métodos cuantitativos no están dirigidos al diagnóstico de la infección, sino al monitoreo de la misma.

Una prueba que pueda cuantificar este virus, podría además ayudar a comprender la dinámica del mismo, como así también la relevancia en pacientes asintomáticos versus los que desarrollan la enfermedad. En general, la CV incide sobre la gravedad de la enfermedad en infecciones virales agudas.

Si bien hay muchas publicaciones sobre la utilidad de la CV, no existen hasta el momento métodos comerciales disponibles.

La composición de una prueba molecular que permita la cuantificación absoluta del número de moléculas de ARN del SARS-CoV-2 mediante RT-PCR a partir de muestras respiratorias, debería incluir:
• Cebadores y sondas que reconozcan específicamente una región genómica del virus, particularmente las publicadas como regiones altamente conservadas (gen RdRp, gen N, etc.).
• Un estándar de ARN viral de SARS-CoV-2 de concentración conocida.
• Una mezcla de reacción que incluya la o las enzimas de retrotranscripción/amplificación en un medio adecuado.
• Es deseable también la incorporación de un Control Interno Endógeno (como un gen constitutivo) que normalice la CV medida al número de células en la muestra biológica respiratoria, minimizando los errores por la heterogeneidad de la misma.

Estudios publicados revelan la importancia de la dinámica de la CV de SARS-CoV-2 para generar algoritmos integrales para la predicción del riesgo y el abordaje de pacientes con COVID-19.
Está descripto en la bibliografía, que la CV de SARS-CoV-2 alcanza su punto máximo dentro de la primera semana de inicio de los síntomas.

Los patrones de ARN viral observados en pacientes con COVID-19 leve y grave, confirman que los casos graves tienden a una alta CV y un período más largo de eliminación del virus. La CV media de los casos graves fue alrededor de 60 veces mayor que la de los casos leves, lo que sugiere que una CV más alta podría estar asociada con resultados clínicos graves.

Además, se encontró que los casos leves tenían un aclaramiento viral temprano; el 90% de estos pacientes dieron repetidamente resultados negativos en la RT-PCR el día 10 después del inicio de la enfermedad. Por el contrario, todos los casos graves dieron positivo en esa misma etapa.
Este hallazgo sugiere que la carga viral del virus podría ser un marcador útil para evaluar la gravedad y el pronóstico de la enfermedad.

También se encontró una asociación independiente entre la CV alta y la mortalidad, por lo que, este marcador podría ser una estrategia útil para la estratificación del riesgo y la selección de las terapias más apropiadas en cada paciente en particular. La CV también es un factor decisivo para la implementación de medidas de aislamiento, en base a la infectividad. Quedan pendientes estudios que puedan revelar con mayor profundidad, la dinámica de la CV en la infección por SARS-CoV-2 y sus posibles relaciones con los anticuerpos neutralizantes, citoquinas, comorbilidades, tratamientos, etc.

¿Puede ser útil entonces la medición de la CV en la práctica clínica? Probablemente sí, ya que un resultado positivo de la RT-PCR puede no significar necesariamente que la persona siga siendo infecciosa o que siga teniendo enfermedad significativa. El ARN podría proceder de un virus no viable y/o la cantidad de virus vivo podría ser demasiado baja para la transmisión.

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